Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Comience descongelando un cultivo congelado de la población bacteriana gramnegativa del donante y el receptor apareados en hielo.

Las células receptoras llevan transposones, segmentos cortos de ADN que incluyen un gen de resistencia para el antibiótico kanamicina. Estos transposones se integran aleatoriamente en el genoma del huésped.

Agregue el cultivo a una placa de agar rica en nutrientes que contenga kanamicina pero sin nutrientes específicos del donante.

Agregue perlas estériles y gire suavemente la placa para esparcir el cultivo de manera uniforme.

Retire las cuentas e incube. Las bacterias receptoras utilizan nutrientes, pero solo aquellas con transposones integrados resisten la kanamicina, lo que lleva a la formación de colonias.

Las bacterias donantes y receptoras sin transposones no crecen.

Cuente las unidades formadoras de colonias para estimar el número de bacterias receptoras con inserciones de transposones únicas.

Agregue medios nuevos y recolecte la población bacteriana.

Centrifugar para granular las bacterias y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en un medio con crioprotector para preservar la viabilidad bacteriana.

Descongele una alícuota del apareamiento