Aislamiento de bacterias gramnegativas con inserciones de transposones genómicos

Comience descongelando un cultivo congelado de la población bacteriana gramnegativa del donante y el receptor apareados en hielo.

Las células receptoras llevan transposones, segmentos cortos de ADN que incluyen un gen de resistencia para el antibiótico kanamicina. Estos transposones se integran aleatoriamente en el genoma del huésped.

Agregue el cultivo a una placa de agar rica en nutrientes que contenga kanamicina pero sin nutrientes específicos del donante.

Agregue perlas estériles y gire suavemente la placa para esparcir el cultivo de manera uniforme.

Retire las cuentas e incube. Las bacterias receptoras utilizan nutrientes, pero solo aquellas con transposones integrados resisten la kanamicina, lo que lleva a la formación de colonias.

Las bacterias donantes y receptoras sin transposones no crecen.

Cuente las unidades formadoras de colonias para estimar el número de bacterias receptoras con inserciones de transposones únicas.

Agregue medios nuevos y recolecte la población bacteriana.

Centrifugar para granular las bacterias y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el gránulo en un medio con crioprotector para preservar la viabilidad bacteriana.

Descongele una alícuota del apareamiento congelado en hielo. Luego, use perlas de vidrio estériles para esparcir 150 microlitros de la dilución, en cada placa de agar Luria-Bertani de 30 por 150 milímetros, complementada con kanamicina.

Deseche el tubo usado que contiene el exceso de apareamiento e incube las placas a 37 grados centígrados durante 14 horas. Después de la incubación, cuente las unidades formadoras de colonias en cada placa para estimar el total de mutantes en la biblioteca de transposones. Cuente el 20% de al menos tres placas para determinar la estimación del recuento de colonias para todo el grupo de placas.

Después de calcular el rendimiento estimado de la colonia, agregue de tres a cinco mililitros de LB a cada placa y raspe las bacterias con una herramienta de raspado estéril. Extraiga las suspensiones bacterianas de todas las placas en tubos cónicos de 50 mililitros y granular las suspensiones centrifugando a 5.000 veces G, durante siete minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de LB, suplementado con glicerol al 30%.

Luego, haga alícuotas de un mililitro de la biblioteca de transposones en crioviales y guárdelas a menos 80 grados Celsius.