Name: Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar extremos libres de F-actina en conos de crecimiento neuronal mediante permeabilización con saponina e incubación con rodamina-actina. Este método permite estudiar la dinámica del citoesqueleto en respuesta a señales de guía axonal.

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Los autores agradecen al Dr. James Bamburg y miembros de su laboratorio para la colaboración en estos estudios. Este trabajo fue financiado por subvenciones del NIH HD19950, EY07133 y por becas de la Fundación Médica de Minnesota.

Para el etiquetado de rodamina-actina, las neuronas se cultivaron en cubreobjetos de vidrio colocados en la parte inferior de 35 mm platos de plástico, o en cubreobjetos pegado en "video" platos. 1. Preparación de platos Cubreobjetos o "Video" <ol><li> Muchos tipos neuronales son poco adhesivo para sustratos in vitro. Cubreobjetos de vidrio, que son necesarios para este procedimiento, no puede permitir que suficientes neuronas sustrato de adhesión, a menos que hayan sido limpiados adecuadamente y preparado. Un procedimiento detallado para el ácido de lavado y limpieza cubreobjetos de vidrio se describe en el libro El cultivo de las células nerviosas, editado por Banker y Goslin. Por otra parte, una capa de nitrocelulosa para el cubreobjetos, que se une con avidez las moléculas de sustrato, se describe en los pasos 1.7 y 1.8 a continuación. </li><li> Cubreobjetos de vidrio (por ejemplo, 18 plazas mm o 24 mm círculos) se lavan en dH 2 O y cocido en calor seco (≥ 225 ° C) el mayor tiempo posible (mínimo de varios días hasta tres meses o más) para eliminar los restos de materia orgánica compuestos. Vaya al paso 1.6 o para platos de vídeo proceder a 1,3. </li><li> Para crear un substrato fino de vidrio transparente para videomicroscopía alta resolución, agujeros circulares de diámetro apropiado son perforados en el fondo de los 35 o 50 mm Petri de plástico o los platos de cultivo de tejidos utilizando un taladro eléctrico de corcho (o un instrumento similar). La perforación se realiza lentamente con una ligera presión para evitar que se rompa el plástico. Los bordes de la perforación se raspan con una tijera para crear una superficie lisa en ambos lados. </li><li> Cubreobjetos de vidrio se limpian para el uso de cultivo de tejidos, como se describe en 1.1 o 1.2. Cubreobjetos se pegan en el lugar sobre los agujeros, no se usen los tóxicos de cemento acuario de silicona (para cubreobjetos 18x18mm, un poco de 12mm de diámetro se utiliza). El cemento se cura durante 24 horas. </li><li> (Los siguientes pasos se realizan utilizando las condiciones de esterilidad) Los platos de vídeo se lavan 3 veces con agua estéril dH 2 O y se deja secar al aire. </li><li> Cubreobjetos están recubiertas con moléculas de sustrato para el cultivo neuronal. En primer lugar, la superficie está recubierta con cubreobjetos (250 l de 18x18 cubreobjetos) una solución de 100 mg / ml de poli-D-lisina en PBS durante 4-8 horas (o toda la noche) en una incubadora humidificada 38 ° C. Cubreobjetos se enjuagan 3 veces con agua estéril dH 2 O para eliminar consolidados poli-D-lisina y se deja secar al aire. Muchos tipos neuronales cultivadas en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina a solas, si las proteínas séricas están incluidos en el medio de cultivo. Sin embargo, los resultados más relevantes para las condiciones in vivo se obtienen mediante el uso de moléculas de sustrato natural. Las soluciones de estas moléculas, como la laminina, fibronectina o L1 CAM (1-20 mg / ml en PBS), se pueden aplicar directamente a la poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos de 4-8 horas o toda la noche, pero en nuestro laboratorio de rutina cubrir el cubreobjetos preparado con una fina película de nitrocelulosa antes de aplicar las moléculas de adhesión celular para aumentar la proteína de unión al sustrato. </li><li> Prepare una solución de nitrocelulosa 1% en la disolución de 5 g de nitrocelulosa en 5 ml de 100% acetato de amilo. Aplique 10 l de esta solución para el cubreobjetos y suavemente repartidas en la superficie. Deje secar al aire 10 minutos. </li><li> Aplicar 250 l de una solución de 25 mg / ml laminina o 4 mg / mL L1 CAM en PBS y se extendió sobre la superficie de nitrocelulosa. Incubar 4 horas (o toda la noche) en un incubador humidificado 38 ° C, el sustrato aspirado e inmediatamente después, medio de cultivo, por lo que el sustrato no se seque. </li></ol> 2. Preparación de los cultivos neuronales <ol><li> Embrionarias día 7 embriones de pollo se eliminan los huevos y los colocó en 100 mm placas de Petri que contienen medio de cultivo con suero al 10% para la disección para extraer los órganos internos del tórax y el abdomen, utilizando un microscopio estereoscópico. </li><li> Los embriones se enjuagan con el medio y se mudó a un plato de 60 mm con medio líquido y más disección para extraer y preparar los explantes de ganglios de la raíz dorsal (GRD) o los tejidos neurales de retina. Una descripción de la disección detallada se puede encontrar en Métodos en Biología Celular, volumen 71, Neuronas: Métodos y Aplicaciones de la Biología Celular, editado por Hollenbeck y Bamburg. Explantes de DRG son los ganglios y nervios 1/2-whole explantes de retina son de 1 mm de diámetro o menos. </li><li> Después de limpiar los explantes de tejidos extraños, los explantes individuales se mueven con unas pinzas de relojero los cubreobjetos, que ya están en placas de cultivo con medio de cultivo. Bajo un microscopio de disección, el explante se presiona suavemente hacia el centro del cubreobjetos con unas pinzas para evitar el movimiento durante el transporte a la incubadora. Los explantes se cultivaron en medio F12 B27 con aditivos, tamponado con HEPES 10 mM a pH 7,4 y se colocan durante la noche en una incubadora humidificada 38 ° C. Los factores de crecimiento se pueden añadir, según sea necesario, al medio de cultivo. Las neurotrofinas son a menudo añadido a DRG culturas de los antiguos embriones, aunque E7 neuronas DRG se extenderá axones de explantes sin neurotrofinas añadió. Explantes de retina neural se extienden los axones en el medio de cultivo sindding factores de crecimiento. </li><li> Los cultivos se incuban durante al menos 18 horas para permitir crecimiento axonal suficiente antes de iniciar el procedimiento siguiente. </li></ol> 3. Preparación de la permeabilización de amortiguación Rodamina-actina <ol><li> Una solución de reserva de permeabilización de amortiguación que contiene 138 mM KCl, 10 mM TUBOS, 3 mM EGTA, 4 mm de MgCl 2, y 1% de BSA (pH = 6,9) se puede mantener hasta 2 semanas a 4 ° C11. Justo antes de su uso, los componentes se añaden a una concentración final de: 0,025% de saponina, 0,1 mM de ATP, y 100 nM Alexa-flúor 350 phalloidin. </li><li> Una solución por separado es también recién preparada justo antes de su uso con estos mismos componentes más rodamina 0.45μM no actina de músculo La solución se agita y tritrated alternativamente durante 5 minutos para disolver la actina rodamina-grupos, y se agita durante 1 minuto durante el paso de permeabilización inicial para prevenir la polimerización en el tubo. Si a pesar de ello, el montaje del filamento en el tubo sigue siendo un problema, la solución puede ser centrifugadas antes de su uso. </li></ol> 4. Permeabilización de cultivos neuronales y la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina Finaliza púas <ol><li> Una placa de cultivo con explantes de DRG o la retina ha sido cuidadosamente retirados de la incubadora y los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente. </li><li> Todos los cambios de las soluciones debe hacerse con cuidado. La punta de la pipeta se debe colocar en el borde del cubreobjetos, y las soluciones deben ser retirados y se añade lentamente y con una fuerza mínima. </li><li> El medio de cultivo se extrae con una pipeta con cuidado, pero sin pausa, y la permeabilización de amortiguación suficiente para cubrir las células se añade durante 1 minuto (para 18mm x 18mm cubreobjetos, ~ 60 l). La cultura no se enjuaga con cualquier otra solución antes de añadir la permeabilización de amortiguación y el cubre no se deja secar antes de añadir la permeabilización de amortiguación. </li><li> La permeabilización de amortiguación se quita suavemente con una pipeta y se sustituye con la permeabilización de amortiguación que contiene 0,45 M rodamina no actina de músculo durante 4 min. </li><li> La rodamina-actina que contiene el tampón se quita suavemente con una pipeta, y las neuronas se fija mediante la adición de una solución de paraformaldehído al 4% (calidad laboratorio, realizados con tampón fosfato, pH 7,3), glutaraldehído al 0,05% y el 10% de sacarosa. Después de la fijación de 5 minutos el cubreobjetos con cuidado son lavadas con PBS, y se montaron en Slowfade en portaobjetos de vidrio de 3 pulgadas. </li><li> Un enfoque alternativo a las soluciones de cambio es el uso de una celda de flujo. Esto puede ser una celda de flujo disponible en el mercado, o una celda de flujo simple se puede hacer mediante la colocación de pequeñas piezas de plástico (≤ 1 mm de espesor) como separadores en las esquinas del cubreobjetos, y luego montar un cubreobjetos de igual tamaño en la parte superior de la cubreobjetos. Las soluciones pueden ser cambiados mediante la colocación de la pipeta a un lado de la celda de flujo y la retirada de las soluciones con una mecha (de algodón o Kimwipe a) en el otro lado. </li><li> La incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas y fluorescentes phalloidin etiquetado de F-actina en los conos de crecimiento se visualiza con epi-fluorescencia óptica a través de un objetivo de inmersión 60X, y las imágenes se recogen, con una cámara CCD enfriado. Un microscopio confocal puede proporcionar mejores imágenes. </li><li> Para un mejor cuantificación de la incorporación de rodamina-actina todas las imágenes se deben recoger en una sola sesión, con la misma ganancia y ajustes de la exposición de la sensibilidad de la cámara digital para cada imagen. Análisis de la etiqueta deberán hacerse en regiones equivalentes de cada imagen; Metamorph, J de la imagen o similares herramientas informáticas para el análisis de imagen se puede utilizar. </li></ol> Variaciones de este procedimiento 5. Una variación: Recoge imágenes de células vivas Antes de etiquetado Rodamina-actina <ol><li> Platos de vídeo se colocan en una platina del microscopio se calentó, y las imágenes en directo cono de crecimiento se recogen. Cubreobjetos cuadrícula se pueden utilizar, o grabados y / o marcas de lápiz sobre el cubreobjetos se puede hacer para encontrar más fácilmente después de células específicas de etiquetado, o el plato de vídeo se puede fijar en su lugar en la platina del microscopio para la duración del procedimiento. </li><li> Permeabilización, la incorporación de rodamina-actina, y la fijación de células se llevan a cabo en el plato de vídeo, ya sea dentro o fuera de la platina del microscopio. Tras la fijación, PBS, se añade a los platos de vídeo para obtener imágenes de inmediato. Para conservar la muestra para obtener imágenes de tarde, media slowfade montaje se añade a la cubreobjetos y un cubreobjetos de igual tamaño, se coloca suavemente en la parte superior (evitando las burbujas), y los bordes son sellados con esmalte transparente. </li></ol> 6. Dos variaciones: inmunoquímica de proteínas etiqueta adicional Co- <ol><li> Rodamina-actina incorporación y fijación puede llevarse a cabo en las neuronas cultivadas en cubreobjetos o en platos de vídeo, como se describió anteriormente (4.2 a 4.4). </li><li> Después de la fijación y lavado en PBS, las células son tratadas 15 min con 0,1 M de glicina en PBS y se extrae con 0,1% Triton X-100 (TX-100) en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h. Cubreobjetosse incubaron con los anticuerpos primarios diluidos en PBS con 1% BSA durante 1 h. Los cubreobjetos se enjuagan y se incubaron en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra 2% y 1% de BSA durante 1 h, antes de aplicar fluorescente secundaria de anticuerpos en la dilución 1:1000 en PBS con BSA al 1% durante 1 h. Después de enjuagar, los cubreobjetos se incuba de nuevo en el 0,1% TX-100 en PBS con suero de cabra al 2% y 1% BSA durante 30 minutos, enjuagar y montar en anti-fading medio. La localización de algunas proteínas se ve interrumpida por el paso de permeabilización inicial (4,3). Para conservar estas proteínas con anticuerpos para la localización, el 0,05% de paraformaldehído y glutaraldehído al 0,05% se puede agregar a la permeabilización de amortiguación durante 1 minuto (es decir, antes de añadir la rodamina-actina), sin afectar el etiquetado final de púas por rodamina-actina. </li><li> Imágenes de los conos de crecimiento de triple etiquetado se recogen mediante microscopía de fluorescencia confocal o. </li></ol> 7. Variación tres: Evaluación de los Efectos de la Cues de orientación sobre la F-actina Finaliza púas gratis <ol><li> Un factor de crecimiento o cue orientación se añade a los platos de la cultura en la incubadora, en concentraciones de varios ng / mL durante unos minutos (o un tiempo de tratamiento apropiado) antes de retirar el plato de la incubadora y el inicio del procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos a corto plazo de los factores de crecimiento o las señales de orientación sobre la F-actina fines de púas libre. </li><li> Un plato de vídeo con cultivos de neuronas puede ser colocado en una platina del microscopio se calentó, y factores de crecimiento o las señales de orientación puede ser liberado de una micropipeta en un gradiente de cerca de un cono de crecimiento antes de comenzar la permeabilización y la incorporación de rodamina-actina. Por ejemplo, el NGF puede ser liberado por las neuronas DRG o netrina de las células ganglionares de la retina neural. La pipeta se pueden introducir para tan corta como 1-2 minutos antes de comenzar el procedimiento de permeabilización. Esto permite la evaluación de los efectos locales de un gradiente de señal de orientación sobre la formación de F-actina extremos libres de púas en los márgenes del cono mayor crecimiento (ver cita de referencia para 10 imágenes). </li><li> Estas variaciones se pueden combinar con mediado por anticuerpos etiquetado de los otros componentes neuronales, como se describe en el apartado 6.2 anterior. </li></ol> 8. Cuatro variación: F-actina Etiquetado extremo libre de púas en las neuronas transfectadas <ol><li> El uso de las construcciones constitutivamente activa o dominante negativo-o una caída de proteínas utilizando RNAi (con un marcador fluorescente de identificación) se puede utilizar para evaluar la participación de una proteína en la regulación de la actina F-termina de púas libre. En función de la proteína, su localización dentro del cono de crecimiento, y si se fusiona con un marcador fluorescente, la proteína fluorescente expresado en las células transfectadas pueden perderse en la permeabilización. Si este es el caso, los platos de vídeo se puede utilizar para identificar una célula transfectada microscopio antes de permeabilización, y la permeabilización se puede realizar en la platina del microscopio, después de marcar las posiciones de las células transfectadas. Por otra parte, una construcción GFP-actina se co-transfectadas con GFP-constructo de interés. En este caso, GFP-actina se incorporarán en la F-actina, y no se pierde por la permeabilización que permita la identificación de las células transfectadas después de permeabilización. </li><li> Esta variación se puede combinar con la adición de las señales de orientación, tal como se describe en el 7,1-7,3 por encima. </li></ol> 9. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Además global de NGF aumenta total de F-actina y la F-actina fines de púas en el borde del cono de crecimiento líder. Cuando un cono de crecimiento DRG se estimula con factor de crecimiento nervioso (NGF) durante 5 minutos, se estimula la polimerización de la actina en el margen principal, y una banda brillante de etiquetado rodamina-actina se ve en la periferia del cono de crecimiento. La Figura 1 compara rodamina-actina incorporación en un cono de DRG crecimiento estimulada y estimulada por un NGF DRG cono de crecimiento. La fluorescencia de color verde en las imágenes fusionadas es etiquetado phalloidin de F-actina en el cono de crecimiento y el rojo rodamina-actina de etiquetado. Un buen control para el etiquetado final de púas es añadir 10-6 M o superior citocalasina B o D en la permeabilización de amortiguación en los pasos 4.2 y 4.3. Citocalasinas tapa F-actina fines de púas e inhibir la rodamina-actina a los fines de púas. Esta grave deben reducir o eliminar la incorporación de la rodamina-actina en la célula. Las barras de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un gradiente de NGF aumenta localmente F-actina fines de púas. Una micropipeta que libera NGF se pone a un lado de un cono de crecimiento DRG durante 2 minutos, seguido por el etiquetado de los F-actina extremos libres de púas. Las siguientes imágenes muestran que la exposición a un gradiente de NGF a nivel local estimula un aumento en la F-actina extremos libres de púas en la región del cono de crecimiento más cerca de la pipeta. La imagen combinada muestra phalloidin en verdey rodamina-actina en rojo. Barra de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Las proteínas activadas MTC se acumulan en el margen de cono de crecimiento importantes. Etiquetado inmunocitoquímico de phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (PERM), con F-actina fines de púas libre. Glutaraldehído (0,05%) y paraformaldehído (0,05%) fueron añadidos a la permeabilización de amortiguación inicial de un minuto para preservar la localización del MTC. Rodamina-actina, de color rojo, PERM, verde, phalloidin, azul. Barra de escala, 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. La estimulación de la polimerización de la actina requiere proteínas activas del MTC. GRD disociadas fueron co-transfectadas con GFP-actina y un control de plásmido GFP o una construcción dominante negativa Ezrin / radixina / Moesin (DN ERM). El uso de GFP-actina permite la identificación de las células transfectadas después de permeabilización. Aquí, el NGF se añadió 5 minutos antes de la etiqueta de la F-actina fines de púas. Nota del cono de crecimiento transfectadas con DN MTC ha reducido los niveles de púas en el margen extremo del cono de crecimiento líder (abajo centro), que contrasta con un cono de crecimiento cercanas untransfected (paneles inferiores), o con el control GFP (panel central superior). Rodamina-actina, de color rojo, GFP-actina, de color verde. Las barras de escala, 10 micras.

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</ol>

Los métodos presentados aquí permiten una resolución temporal y espacial de los componentes celulares que participan en la remodelación dinámica del citoesqueleto de actina en el borde principal de la migración de los conos de crecimiento. La acción de las moléculas de atrayente, como NGF o netrina, para estimular la rápida polimerización de la actina del filamento se revela como un aumento local en los extremos de actina de púas, creado por la ruptura de filamentos de actina por la activación de ADF / cofilina 10,...

<table><tbody><tr><td>Cubrebocados de 18x18 mm</td><td>Gold Seal</td><td>3305</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cemento para acuarios</td><td></td><td>Sellador de silicona al 100 % DAP para acuarios</td><td>Cualquier ferretería</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina (pm &amp;gt; 300.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td></td></tr><tr><td>Laminina natural de ratón</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>L1 CAM</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>777-NC</td><td></td></tr><tr><td>Faloídicina Alexa Fluor 350</td><td>Invitrogen</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>Actina no muscular rodamina</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td></td></tr><tr><td>Medio de cultivo F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700-075</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Slowfade </td><td>Invitrogen</td><td>536937</td><td></td></tr></tbody></table>

etiquetado de la f-actina finaliza púas con rodamina-actina en permeabilizadas conos de crecimiento neuronal

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Las puntas móviles de los axones en crecimiento se llaman los conos de crecimiento. Los conos de crecimiento llevan navegando a través de los axones tejidos en desarrollo mediante la interacción con las señales a nivel local expresó su orientación molecular que se unen a los receptores de cono de crecimiento y regular la dinámica y la organización del citoesqueleto de crecimiento de 6.3 cono. El objetivo principal de estas señales de navegación es la malla de filamentos de actina que llena la periferia del cono de crecimiento y que el crecimiento de las unidades de la motilidad del cono a través de polimerización de la actina y la remodelación continua dinámica 7. Señales de orientación positiva o atractivo inducir cono de crecimiento de inflexión mediante la estimulación de filamentos de actina (F-actina) de polimerización en la región de la periferia del cono de crecimiento que está más cerca de la fuente de la señal atrayente. Esta polimerización de la actina unidades cono de crecimiento local saliente, la adhesión del margen de líderes y la elongación axonal hacia el atrayente. Polimerización de la actina del filamento depende de la disponibilidad de monómero de actina suficiente y en los núcleos de polimerización de filamentos de actina o los extremos de púas para la adición de monómero. Actina monómero está disponible en abundancia en el ganglio de la raíz de pollo y la retina dorsal (GRD) los conos de crecimiento. En consecuencia, la polimerización se incrementa rápidamente cuando es libre F-actina fines de púas que se disponga para la adición de monómeros. Esto ocurre en el pollo y los conos de la retina DRG crecimiento a través de la activación local de la actina cortar la F-actina proteína de factor de despolimerización (ADF / cofilina) en la región del cono de crecimiento cercano a un 80-10 atrayente. Este incremento de la ADF / cofilina actividad rompe los filamentos de actina para crear nuevos F-actina fines de púas para la polimerización. El método siguiente se muestra este mecanismo. Contenido total de F-actina se visualizaron por tinción con phalloidin fluorescente. F-actina fines de púas son visualizados por la incorporación de la rodamina-actina dentro de los conos de crecimiento que se permeabilized con el procedimiento descrito en el siguiente, que es una adaptación de los estudios previos de otras células móviles 11, 12. Cuando rodamina-actina se añade a una concentración por encima de la concentración crítica para la adición de monómeros de actina a los fines de púas, rodamina-actina reúne a los extremos libres de púas. Si la señal atractiva se presenta en una pendiente, como la de ser liberado de una micropipeta colocada a un lado de un cono de crecimiento, la incorporación de la rodamina-actina en la F-actina fines de púas será mayor en el lado del cono de crecimiento hacia la micropipeta 10 . Los conos de crecimiento son las estructuras celulares pequeños y delicados. Los procedimientos de permeabilización, rodamina-actina incorporación, la fijación y la visualización de fluorescencia son cuidadosamente hecho y puede llevarse a cabo en el escenario de un microscopio invertido. Estos métodos pueden ser aplicados al estudio de polimerización de la actina en las neuronas migratorias locales, otras células de los tejidos primarios o líneas celulares.

Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.

Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal

Los extremos móviles de los axones en crecimiento se denominan conos de crecimiento. Los conos de crecimiento guían a los axones que navegan a través de los tejidos en desarrollo mediante la interacción con factores locales...

El objetivo general del siguiente experimento consiste en visualizar la ubicación y el número de filamentos de actina libres, así como de extremos orientados (barbed ends) disponibles para la polimerización de actina en conos de crecimiento neuronales expuestos a señales de orientación axonal. Esto se logra primero sumergiendo neuronas cultivadas sobre cubreobjetos en un tampón que contiene saponina, con el fin de hacer permeables los conos de crecimiento. A continuación, las células se exponen a un tampón que contiene actina rumina durante cuatro minutos, lo que permite que la actina rumina ingrese a los conos de crecimiento y se polimerice sobre los extremos orientados libres de la actina F.Finalmente, las células se fijan químicamente y se lavan para preservar la distribución de la actina F. Extremos en punta que han incorporado actina rumina. Basado en microscopía de fluorescencia y análisis cuantitativo de imágenes, se obtienen resultados que muestran que las señales quimiotácticas atractivas aumentan el número de f efectina libre.Extremos con espina en el borde delantero de los conos de crecimiento en migración. Hola, soy Paul Erno del Departamento de Neurociencia de la Escuela de Medicina de la Universidad de Minnesota. Hoy vamos a demostrar cómo preparar cultivos de conos de crecimiento neuronal de pollo.Demostraremos un método para visualizar en los conos de crecimiento las puntas libres de los filamentos de actina, que son los componentes dinámicos del citoesqueleto responsables de impulsar los axones hacia adelante mientras se desplazan a través de los embriones hasta sus objetivos sinápticos. Aunque utilizamos este método para investigar la dinámica de la actina y los conos de crecimiento nerviosos, puede aplicarse también a otras células nerviosas móviles, como la glía, las células de la cresta neural o las neuronas migratorias. Demostración de los procedimientos.Hoy estarán presentes los miembros del laboratorio, Bonnie Marek, investigadora postdoctoral, y Jose San Miguel Ruiz, estudiante de medicina y doctorado. Para preparar los platillos de video utilizados en la etiqueta del actina neuronal con rumina, enjuague cubreobjetos de vidrio cuadrados de 18 milímetros o circulares de 24 milímetros con agua destilada y colóquelos a secar en calor seco durante tres meses o más. Pueden sustituirse otros métodos de limpieza de cubreobjetos en lugar del horneado. Taladre orificios circulares del diámetro adecuado en el fondo de placas de Petri o de cultivo de tejidos plásticas de 35 o 50 milímetros utilizando un sacabocados, taladro u otro instrumento. Luego, raspe los bordes de los orificios taladrados con tijeras para crear una superficie lisa en ambos lados.A continuación, se pega una laminilla limpia sobre el orificio de cada placa con cemento de acuario de silicona y se enjuagan las placas varias veces con agua destilada estéril. Las placas ya están listas para el recubrimiento del sustrato. Aplique una solución de 100 microgramos por mililitro de PDL en PBS sobre las laminillas o placas para video e incube de dos a cuatro horas en un incubador húmedo a 38 grados Celsius.Aspire la solución de PDL y enjuague las laminillas tres veces con agua destilada estéril; deje secar al aire. A continuación, prepare una solución al 1% de nitrocelulosa disolviendo cinco miligramos de nitrocelulosa en cinco mililitros de acetato de amilo. Aplique 10 microlitros de esta solución sobre la parte superior de una laminilla e inclínela para extenderla por toda la superficie; deje secar al aire aproximadamente 10 minutos.Finalmente, aplique 250 microlitros de laminina a 25 microgramos por mililitro, o L1CAM a cuatro microgramos por mililitro en PBS, y extiéndalo sobre la superficie de nitrocelulosa. Incube de seis a ocho horas en un incubador húmedo a 38 grados Celsius. Luego, en una cabina de cultivo celular, aspire el sustrato y agregue inmediatamente medio de cultivo, asegurándose de que el sustrato no se seque. Explan.Los cultivos de ganglios de la raíz dorsal o GRD o tejidos retinianos neuronales se preparan mediante la disección de embriones de pollo de siete días de desarrollo embrionario. Los implantes de GRD corresponden a la mitad de un ganglio completo y los explantes retinianos tienen un diámetro de un milímetro o menos.Bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas para colocar el explante sobre la laminilla. Luego presiónelo suavemente en el centro de la laminilla para evitar movimientos mientras se transporta al incubador. Las placas con laminillas se trasladan con cuidado y se colocan en un incubador cálido y humedecido durante la noche o durante 18 horas.Durante este período, los axones se extienden varios cientos de micrómetros desde el explante. Prepare el tampón de permeabilización de actina rumina añadiendo los siguientes componentes: saponina A TP y LOR tres 50 fein. La composición de este tampón se describe en el protocolo escrito.Prepare una solución separada utilizando los mismos componentes más 0,45 micromolar de ermine non-muscle actin T rate y vortexee para mezclar y permeabilizar y etiquetar las células neuronales. Retire cuidadosamente del incubador una placa de cultivo con implantes de DRG o retina y realice los siguientes pasos a temperatura ambiente. Con una pipeta, retire cuidadosamente el medio de cultivo y agregue suficiente tampón de permeabilización para cubrir las células; incube durante un minuto.Retire suavemente el tampón de permeación y sustitúyalo por el tampón que contiene 0,45 micromolar de actina no muscular de rumiante; incube durante cuatro minutos. Finalmente, retire el tampón que contiene actina de rumiante y fije las neuronas con paraformaldehído al 4% y glutaraldehído al 0,05% durante cinco minutos. Enjuague suavemente con PBS y monte con slow fade en portaobjetos de vidrio de tres pulgadas.Utilice un microscopio de fluorescencia epifluorescente equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 60 x para visualizar la incorporación de la actina R domine en la actina F, los extremos punta y la marcación fluorescente de la actina F en los conos de crecimiento, a fin de obtener la mejor cuantificación de la incorporación de actina R domine. Todas las imágenes deben recolectarse en una sola sesión utilizando los mismos ajustes de ganancia de sensibilidad y tiempo de exposición de la cámara digital para cada imagen. Analice la marcación de regiones equivalentes utilizando Metamorph Image J o un software de análisis de imágenes similar.También se pueden realizar varias variaciones de este procedimiento. Una variación implica inmunoquímica para localizar otras proteínas además de la F actina y los extremos barbados. Después de fijar la actina rumina incorporada y lavar con PBS, se pueden añadir anticuerpos frente a otro componente del cono de crecimiento, seguido de lavados, bloqueo e incubación con un anticuerpo secundario fluorescente adecuado para marcado triple con actina r domine y falina fluorescente.Una tercera variación evalúa los efectos de las señales de orientación sobre F FACT y extremos libres en punta mediante la adición de un factor de crecimiento o señal de orientación a las placas de cultivo en el incubador durante cinco a 15 minutos antes de retirar la placa del incubador e iniciar el procedimiento de permeabilización. Esto permite evaluar los efectos a corto plazo de los factores de crecimiento o señales de orientación sobre FAC y extremos libres en punta. Alternativamente, coloque una placa para video con cultivos neuronales sobre la platina calentada de un microscopio y utilice una micropipeta para liberar factores de crecimiento o señales de orientación en un gradiente frente al cono de crecimiento neuronal antes de iniciar la permeabilización y la incorporación de actina marcada.Los factores de crecimiento pueden introducirse durante tan solo uno o dos minutos antes de comenzar el procedimiento de permeación. La permeación y la fijación pueden realizarse manteniendo el cultivo en el portaobjetos sobre la platina del microscopio. Esto permite evaluar los efectos locales de un gradiente de señal de orientación sobre la formación de F ACT y extremos libres en punta de flecha en los conos de crecimiento.Este video muestra la rápida expansión del margen del cono de crecimiento en respuesta a la adición global de NGF. Cuando un cono de crecimiento de ganglio dorsal se trata globalmente con factor de crecimiento nervioso durante cinco minutos, se estimula la polimerización de actina en el margen anterior y se observa una banda brillante de incorporación de actina rumina alrededor del perímetro del cono de crecimiento. Este video muestra un cono de crecimiento que gira hacia una micropipeta que libera NGF y crea un gradiente de NGF mostrado aquí.Cuando se expone un lado de un cono de crecimiento de ganglio dorsal a un gradiente de NGF durante dos minutos, se estimula localmente un aumento en la incorporación de actina R domine a la F act y a los extremos libres en punta. En este ejemplo, la distribución de la rínidina moin fosforilada se revela mediante inmunoquímica. Además de marcar la F ACT y los extremos libres en punta mediante la incorporación de actina R domine cuando se añade NGF globalmente aquí, las neuronas del ganglio dorsal se transfectaron simultáneamente con actina GFP y un constructo dominante negativo de ezrina ridin moisan; se añadió NGF cinco minutos antes del marcado de los extremos en punta de la actina F.Observe que el cono de crecimiento transfectado con el constructo dominante negativo de ERM presenta pocos extremos en punta de F-actina en el margen delantero del cono de crecimiento, lo cual contrasta con un cono de crecimiento cercano no resecado. Al combinar este procedimiento con inmunoquímica, la localización de la F-actina y los extremos en punta puede relacionarse con la distribución de otras proteínas que regulan la dinámica y organización del actinio. Al realizar este procedimiento, es importante tener cuidado de no alterar la estructura delicada de los conos de crecimiento neurales.

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Este video muestra el procedimiento para teñir fluorescentemente neuronas corticales de rata para microscopía. Se dirige a las proteínas F-actina y dendríticas para analizar la integridad estructural y calcular la densidad de F-actina, que es crucial para estudiar la función y la salud neuronal.

Cuantificación de actina puncta filamentosa en neuronas corticales de rata

Fuente: Alluri, H., et al. Privación y reoxigenación de oxígeno-glucosa como modelo de lesión in vitro por isquemia-reperfusión para el estudio de la disfunción de la barrera hematoencefálica. J. Vis. Exp. (2015). El video demuestra la localización fluorescente de proteínas de unión estrecha y fibras de estrés en células endoteliales microvasculares del cerebro de rata (RBMEC). En la monocapa sometida a estrés, se utilizan anticuerpos marcados con fluorescencia para marcar las proteínas de...

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La actina filamentosa (F-actina) juega un papel importante en la espinogénesis, la plasticidad sináptica y la estabilidad sináptica. Por lo tanto, la cuantificación de los puntos de F-actina es una herramienta útil para estudiar la integridad de las estructuras sinápticas. Este protocolo describe los procedimientos de cuantificación de los puntos de F-actina marcados con faloidina en cultivos de neuronas corticales primarias de baja densidad.

La cuantificación de la actina filamentosa (F-actina) puntos lagrimales en las neuronas corticales de rata

Las moléculas de guía de axones regulan la migración neuronal y la navegación dirigida del cono de crecimiento. Presentamos un potente método, el ensayo de rayas, para evaluar la capacidad de las moléculas guía para atraer o repeler neuronas. En este protocolo, demostramos el ensayo de rayas mostrando la capacidad de FLRT2 para repeler neuronas del hipocampo cultivadas.

Raya de ensayo para estudiar la actividad de atracción o repulsión de un sustrato de proteína usando las neuronas del hipocampo disociadas

Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.

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Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

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Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Aprende a visualizar y cuantificar extremos libres de F-actina en conos de crecimiento neuronal mediante permeabilización con saponina e incubación con rodamina-actina. Este método permite estudiar la dinámica del citoesqueleto en respuesta a señales de guía axonal.

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