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Microbiología
0 vistas • 3:27 min • September 26th, 2025
Comience con un cultivo de E. coli pretratado con un antibiótico.
Este antibiótico bloquea la división celular, lo que resulta en la formación de células filamentosas alargadas con mayor contenido de ADN.
Coloque una porción del cultivo en una placa de agar rica en nutrientes e incube.
Las células filamentosas no se dividen a pesar del crecimiento continuo; Solo las células no filamentosas forman colonias, lo que resulta en recuentos bajos de colonias.
Diluya el cultivo bacteriano restante y agregue un tinte fluorescente de unión al ADN. Luego, incube en la oscuridad.
El tinte ingresa a las células y se une al ADN.
Agite la muestra y luego pásela a través de un citómetro de flujo.
La cantidad de luz dispersa de cada celda corresponde a su tamaño.
De manera similar, la fluorescencia emitida por los ácidos nucleicos unidos a colorantes indica el contenido de ADN bacteriano.
Las células tratadas con antibióticos muestran un aumento de la dispersión y la fluorescencia, lo que refleja un crecimiento filamentoso y una replicación continua del ADN sin división.
Esto demuestra modificaciones en la fisiología bacteriana causadas por antibióticos inhibidores de la división celular.
Preparar diluciones seriadas diez veces, hasta 10 hasta la menos séptima, de los 200 microlitros de muestra de cultivo en medio fresco.
Mezclar entre cada dilución mediante un vórtice muy suave o invirtiendo el tubo. Coloque 100 microlitros de la dilución adecuada en placas de agarosa LB no seleccionadas e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cuente el número de colonias para determinar la concentración de células viables en cada muestra de cultivo.
Grafique la UFC por mililitro en función del tiempo para los cultivos celulares tratados y no tratados. Mida el OD 600 del cultivo en un espectrofotómetro. Diluir la muestra de cultivo con medio fresco a cuatro grados centígrados para obtener una muestra con DO 600 a 0,06, lo que corresponde a aproximadamente 15.000 células por microlitro.
Para la tinción de ADN, mezcle la muestra bacteriana diluida con una solución de 10 microgramos por mililitro de tinte fluorescente de ADN en una proporción de volumen de uno a uno e incube en la oscuridad durante 15 minutos. Antes de inyectar la muestra, mezcle la muestra mediante un vórtice muy suave o invirtiendo el tubo. Pase la muestra al citómetro de flujo a una velocidad de flujo de aproximadamente 120,000 células por minuto.
Adquiera luz de dispersión frontal y lateral, así como colorante fluorescente de ADN/señal fluorescente con los ajustes adecuados.