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Una espora bacteriana permanece inactiva debido a una capa de corteza de peptidoglicano, un polímero de azúcares y aminoácidos.
Durante la germinación, la corteza se degrada para liberar azúcares en el medio circundante.
Para detectar la degradación de la corteza, comience con el medio que contiene los azúcares liberados, recolectados en puntos de tiempo definidos durante la germinación de las esporas.
Utilice concentraciones crecientes de estándares de azúcar como referencia.
Los patrones y las muestras se sometieron a un tratamiento previo para convertir los azúcares en una forma reactiva.
Incubar con el reactivo de Ehrlich, un reactivo de detección colorimétrica que reacciona con los azúcares y forma un complejo de color púrpura.
Transfiera las mezclas a una placa multipocillo y mida la absorbancia de los complejos coloreados con un lector de microplacas.
La absorbancia corresponde a la intensidad del color púrpura, que es directamente proporcional a la concentración de azúcar.
Un aumento en la absorbancia a través de muestras de puntos de tiempo indica una degradación progresiva de la corteza.
Genere un gráfico a partir de las concentraciones estándar y cuantifique las concentraciones de la muestra.
Mientras las muestras están en hielo, prepare el reactivo de color. Disuelva 0,320 gramos de DMAB en 1,9 mililitros de ácido acético glacial. Tenga en cuenta que este reactivo es sensible al tiempo, la temperatura y la luz y no debe prepararse con anticipación.
Después de que el DMAB se disuelva por completo, agregue 100 microlitros de ácido clorhídrico normal y agite la muestra. Luego agregue cinco mililitros de ácido acético glacial y vórtice nuevamente. Para la reacción colorimétrica, transfiera 100 microlitros de cada corteza enfriada o muestra de control a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Agregue 700 microlitros de la solución de color recién preparada a cada muestra. Transfiera inmediatamente las muestras a un baño de agua a 37 grados Celsius e incube las muestras durante exactamente 20 minutos. Después de la incubación, transfiera 200 microlitros de cada muestra a una placa transparente de 96 pocillos.
Las muestras deben ser de color amarillo para empezar, pero cambiarán a púrpura si hay azúcar reductora, lo que indica la presencia de corteza. Aquí, muchas de las muestras no muestran un color púrpura visible. Sin embargo, las muestras de 250, 500 y 5.000 nanomoles parecen visualmente diferentes de las de control negativo cero nanomol.
Usando un lector de placas, determine la absorbancia a 585 nanómetros. Cuando se mide en un diámetro exterior de 585 nanómetros, la señal generada a partir de las muestras estándar se ajusta mejor a una regresión lineal.