Producción y recuperación de proteínas recombinantes a partir de vesículas derivadas de bacterias

Comience con un cultivo de una especie bacteriana que codifique proteínas recombinantes marcadas con el péptido nucleante de vesículas, o VNp, un péptido corto que promueve la formación de vesículas.

Agregue un inductor al cultivo e incube. El inductor desencadena la expresión de proteínas.

VNp se incrusta en la membrana interna y promueve la curvatura de la membrana, encapsulando las proteínas marcadas con VNp en vesículas en ciernes.

Transfiera el medio rico en vesículas a un tubo. Centríquelo para separar el sobrenadante rico en vesículas.

A continuación, filtre el sobrenadante para eliminar los contaminantes residuales.

Luego, pase el filtrado a través de otro filtro de membrana para capturar vesículas en la superficie de la membrana.

Coloque la membrana en un plato y agregue solución salina tamponada con fosfato.

Separe suavemente las vesículas y transfiera la suspensión a un tubo limpio.

Sonicar la suspensión para alterar las membranas de las vesículas y liberar las proteínas.

Centrifugar el lisado para separar los fragmentos de membrana.

El sobrenadante resultante contiene proteínas recombinantes purificadas, listas para su análisis.

Induzca la expresión de proteínas recombinantes del promotor T7 agregando IPTG a una concentración final de hasta 20 microgramos por mililitro, u 84 micromolares. Después de dejar suficiente tiempo para la inducción, granular las células por centrifugación a 3000 g y 4 grados Celsius durante 20 minutos. Pase el sobrenadante a través de un filtro PES de 0,45 micras estéril y sin detergente para esterilizar el medio que contiene la vesícula para su almacenamiento a largo plazo.

Para concentrar las vesículas en un volumen más pequeño, pase la vesícula estéril que contiene el medio a través de un filtro MCE de 0,1 micras estéril y sin detergente. Luego, lave suavemente la membrana con 0.5 a 1 mililitros de solución salina tamponada con fosfato estéril, o PBS, y use un raspador celular o un esparcidor de plástico para eliminar cuidadosamente las vesículas de la membrana. Transfiera el concentrado de vesículas a un tubo de microcentrífuga nuevo con una pipeta.

Las vesículas purificadas se pueden almacenar a 4 grados centígrados. Sonicar las vesículas que contienen proteínas en los medios estériles utilizando un programa adecuado para alterar las membranas lipídicas vesiculares y liberar proteínas. Centrifugar la suspensión sonicada a 39.000 g y 4 grados centígrados durante 20 minutos para eliminar los restos vesiculares.