Detección de inhibidores de la pirofosfatasa unida a la membrana bacteriana mediante un ensayo colorimétrico

La pirofosfatasa bacteriana unida a la membrana, o mPPasa, hidroliza el pirofosfato en ortofosfato mientras bombea iones de sodio a través de la membrana.

Para evaluar los efectos inhibidores contra las mPPasas, agregue concentraciones crecientes de patrones de fosfato a las tiras de tubos.

Introduzca compuestos de prueba, que pueden inhibir la mPPasa, en los tubos, dejando uno con agua como control.

Agregue mPPasas incrustadas en liposomas derivadas de la bacteria termófila Thermotoga maritima a todos los tubos excepto a los estándares.

Sellar e incubar a la temperatura óptima para activar la enzima.

Agregue pirofosfato de sodio para iniciar la reacción y liberar ortofosfato.

Transfiera los tubos a una plataforma de enfriamiento para detener la reacción y centrifugar para eliminar la condensación.

Agregue el reactivo de molibdato-ascorbato para reaccionar con ortofosfato y formar ácido fosfomolíbdico.

Agregue la solución de arsenito-citrato para reducir el ácido, formando un complejo azul estable.

Transfiera el contenido a una placa multipocillos y mida la absorbancia.

Una absorbancia más baja en comparación con el control indica inhibición de la mPPasa, mientras que los patrones sirven com