JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:15 min • October 30th, 2025
Tome como referencia un portaobjetos que contenga esporas bacterianas latentes y microesferas fluorescentes.
Las esporas llevan reporteros fluorescentes rojos y verdes para las proteínas de germinación, con la membrana interna teñida con un tinte lipofílico.
Monte el portaobjetos en un microscopio de iluminación estructurada o SIM equipado con un objetivo de inmersión en aceite.
Localice las microesferas fluorescentes y ajuste el enfoque para minimizar el desenfoque de la imagen.
A continuación, use luz transmitida para localizar las esporas bacterianas.
Cambie al modo SIM e ilumine las esporas para excitar los fluoróforos.
Adquiera imágenes de fluorescencia de alta resolución en toda la profundidad de las esporas.
En la membrana interna teñida con tinte lipofílico, las proteínas de germinación aparecen como focos rojos y verdes distintos. Esto permite un mapeo preciso de la ubicación de las proteínas de germinación dentro de las esporas bacterianas.
Para obtener imágenes de las muestras, coloque el portaobjetos en un microscopio de iluminación estructurada equipado con un objetivo de aceite de 100X y concéntrese en las microesferas fluorescentes de 100 nanómetros.
Ajuste el anillo de corrección en el objetivo 100X hasta obtener una función de dispersión de puntos simétrica para minimizar el desenfoque de las imágenes y seleccione un campo de visión con aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique un ajuste de enfoque de rejilla para las longitudes de onda de excitación designadas, en este caso, 561 y 488 nanómetros, como guía para el software de análisis de imágenes antes de enfocar las esporas con la luz de transmisión. Capture una imagen de luz de transmisión en el modo promedio de 16X con exposiciones de 20 milisegundos para cada imagen.
A continuación, capture imágenes fluorescentes en bruto del microscopio de iluminación estructurada en 3D de las esporas con el modo de iluminación 3D-SIM.