Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:04 min. • October 30th, 2025
Comience con células de ameba de Dictyostelium discoideum de tipo salvaje suspendidas en un tampón frío.
El tampón proporciona un entorno iónico que mantiene la estabilidad de la membrana.
A continuación, agregue las células de ameba a un tubo que contenga un plásmido con el gen objetivo.
Mezcle suavemente la solución para que los plásmidos entren en contacto cercano con la superficie de la ameba.
Transfiera esta mezcla a una cubeta de electroporación preenfriada y realice la electroporación.
Durante la electroporación, los pulsos eléctricos crean poros transitorios en la membrana celular.
El plásmido ingresa a través de estos poros al citoplasma y posteriormente se transloca al núcleo.
A continuación, transfiera las células de ameba a una placa de Petri que contenga un medio líquido complementado con bacterias alimentadoras.
La ameba consume bacterias a través de la fagocitosis, proporcionando nutrientes esenciales para la recuperación celular y permitiendo la expresión de plásmidos.
Las bacterias alimentadoras apoyan la transfección en células de ameba de tipo salvaje, sin la necesidad de cepas especiales que crecen sin bacterias.
Vuelva a suspender las celdas en el tampón H40.
A continuación, agregue 100 microlitros de las células a un tubo que contenga uno o dos microgramos de ADN. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar y transferir la mezcla de ADN celular a una cubeta de electroporación preenfriada.
No agregue más de dos microgramos de ADN. Una mayor concentración de ADN es tóxica para las células y reduce la eficiencia.
Después de la electroporación, transfiera inmediatamente las células a una placa de Petri de 10 centímetros preparada y deje que las células se recuperen durante cinco horas.