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Tome un lisado bacteriano que contenga proteínas hidrofílicas, lipoproteínas y agregados de proteínas.
Agregue un detergente frío no iónico capaz de separar las fases a temperaturas más cálidas.
Incubar en hielo y mezclar periódicamente. El detergente se une a la fracción lipídica de la lipoproteína, formando complejos proteína-detergente.
Caliente la mezcla para inducir la separación de fases. Las lipoproteínas se concentran en la fase detergente, mientras que las proteínas hidrofílicas permanecen en la fase acuosa.
Centrifugar a temperatura ambiente para mantener la separación bifásica.
Deseche la fase acuosa, agregue un tampón frío a la fase detergente y mezcle.
Repita el ciclo de enfriamiento, calentamiento y centrifugación para enriquecer las lipoproteínas.
Luego, agregue tampón frío y centrifugue a baja temperatura para granular los agregados no lipoproteicos.
Transfiera el sobrenadante a un tubo que contenga un disolvente precipitante de proteínas e incube a temperatura bajo cero para precipitar lipoproteínas.
Centrifugar a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Las lipoproteínas precipitadas están listas para estudios posteriores.
Suplementar el sobrenadante con tensioactivo TX-114 hasta una concentración final del 2% añadiendo un volumen igual de tensioactivo al 4% en TBSE helado. Incube el sobrenadante suplementado en hielo durante una hora, mezclando por inversión cada 15 minutos. Transfiera el tubo a un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 10 minutos para inducir la separación de fases.
Centrifugar la muestra a 10.000 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente para mantener la separación bifásica. Pipetear suavemente la fase acuosa superior y desechar. Agregue TBSE helado a la fase de surfactante inferior para rellenar el tubo a su volumen original e invierta para mezclar.
Incubar en hielo durante 10 minutos. Después de la incubación, transfiera el tubo a un baño de agua a 37 grados Celsius e incube durante 10 minutos para inducir la separación de fases, luego centrifugue a 10,000 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de repetir estos pasos una vez más para un total de tres separaciones, retire la fase acuosa superior y deséchela.
Elimine el gránulo de proteínas precipitadas que se formaron durante el curso de las extracciones agregando un volumen de TBSE helado a la fase tensioactiva. Centrifugar a cuatro grados centígrados y 16.000 veces g durante dos minutos para granular la proteína insoluble. Transfiera inmediatamente el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo de 2.0 mililitros que contenga 1,250 microlitros de acetona al 100%.
Mezcle la muestra por inversión e incube durante la noche a menos 20 grados centígrados para precipitar la proteína. Al día siguiente, centrifugar la muestra a 16.000 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente para granular las lipoproteínas con atención a la orientación del tubo. Lave el gránulo dos veces con acetona al 100% antes de decantar la acetona y dejar que la muestra se seque al aire.
Luego, agregue de 20 a 40 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares, pH 8.0, y vuelva a suspender completamente el gránulo pipeteando hacia arriba y hacia abajo contra la pared con las lipoproteínas precipitadas.