Un procedimiento para la purificación de una proteína marcada con polihistidina de Streptococcus mutans
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 4:28 min • October 30th, 2025
Tome un cultivo de Streptococcus mutans que expresa una proteína marcada con polihistidina secretada en el medio.
Centrifugar el cultivo y recoger el sobrenadante rico en proteínas.
Agregue sulfato de amonio e incube agitando para precipitar las proteínas reduciendo su solubilidad.
Transfiera la solución a un tubo, centrífuga y deseche el sobrenadante.
Vuelva a suspender el gránulo en un tampón de unión que contenga sales y bajo imidazol para estabilizar la proteína.
Dializar la solución contra el tampón aglutinante fresco para eliminar el exceso de sales.
Centrifugar la solución dializada para granular los desechos insolubles, luego filtrar el sobrenadante.
Mezcle el filtrado con resina de afinidad cargada de níquel e incube para permitir la unión selectiva de la proteína marcada con polihistidina a los iones de níquel.
Cargue la mezcla en la columna de cromatografía y lave con tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas.
A continuación, agregue un tampón de elución con alto imidazol para desplazar la histidina de los iones de níquel y liberar la proteína marcada con polihistidina.
Recoge este eluido que contiene las proteínas purificadas.
Centrifugar la suspensión de cultivo bacteriano durante 20 minutos a 10.000 veces g a cuatro grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante de cultivo a un vaso de precipitados de vidrio de tres litros. Para concentrar las proteínas del sobrenadante de cultivo, coloque el sobrenadante de dos litros en un agitador magnético y comience a agitar vigorosamente. Agregue 1,122 gramos de sulfato de amonio y deje que se forme el precipitado agitando vigorosamente a cuatro grados Celsius durante un período de 4 horas o durante la noche.
A continuación, centrifugar la solución precipitada de sulfato de amonio a 15.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante. Con una espátula, recoja el precipitado y transfiéralo a un vaso de precipitados de vidrio de 200 mililitros.
Vuelva a suspender los gránulos en 35 mililitros de tampón de unión. Luego, transfiera cada aproximadamente 25 mililitros de la suspensión a un tubo de diálisis de celulosa regenerada. Coloque el tubo de diálisis en 2,5 litros del tampón de unión de agitación en un agitador a cuatro grados centígrados para dializar la suspensión.
Reemplace la solución de diálisis después de dos horas y continúe la diálisis durante la noche. A continuación, transfiera la suspensión dializada del tubo a los tubos de centrífuga y coloque los tubos en la centrífuga a 20.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con el equipo de filtración por succión, vierta el sobrenadante sobre un filtro de membrana de 0.2 micrómetros para filtrar.
Transfiera el filtrado a un matraz de 75 mililitros.
Para fraccionar el gtfSI marcado con polihistidina de la suspensión filtrada, primero prepare una cromatografía de afinidad de metales inmovilizados. Después de equilibrar la resina de acuerdo con el manuscrito, cierre la llave de pellizco Hoffman.
Agregue cinco mililitros de la suspensión filtrada en la columna para hacer una suspensión. Luego, transfiera toda la suspensión a la suspensión filtrada restante y agite la mezcla suavemente durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a cargar la mezcla en la columna.
Abra el grifo de pellizco Hoffman para quitar la suspensión por el flujo de gravedad. Lave la resina IMAC con 20 mililitros de tampón de unión y luego, eluya 20 mililitros de tampón de elución para obtener el gtfSI recombinante.
Resumen
Este artículo describe un protocolo detallado para la purificación de una proteína marcada con polihistidina a partir de cultivos de Streptococcus mutans. El proceso incluye precipitación con sulfato de amonio, diálisis y cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) para obtener una alta pureza de la proteína diana.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Microbiología
- Purificación de proteínas
Antecedentes
- Streptococcus mutans es una bacteria significativa en la caries dental.
- Las proteínas con etiqueta de polihistidina se utilizan comúnmente en la purificación de proteínas.
- La cromatografía de afinidad es una técnica potente para aislar proteínas.
- Comprender los métodos de purificación de proteínas es fundamental para la investigación bioquímica.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la purificación de proteínas con etiqueta polihistidina.
- Mejorar el rendimiento y la pureza de la proteína diana a partir de cultivos bacterianos.
- Proporcionar un protocolo paso a paso para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Centrifugación para separar el sobrenadante rico en proteínas de las células bacterianas.
- Precipitación con sulfato de amonio para concentrar las proteínas.
- Dialisis para eliminar las sales en exceso de la solución proteica.
- Cromatografía de afinidad con metal inmovilizado para la unión selectiva y elución de proteínas.
Resultados principales
- Concentración exitosa de proteínas con etiqueta polihistidina a partir del sobrenadante de cultivo.
- Alta pureza de la proteína diana obtenida mediante IMAC.
- El protocolo demostró reproducibilidad y eficiencia en la purificación de proteínas.
Conclusiones
- El método descrito es eficaz para la purificación de proteínas con etiqueta de polihistidina.
- Proporciona un recurso valioso para investigadores que trabajan con Streptococcus mutans.
- Las aplicaciones futuras podrían incluir el estudio de las propiedades funcionales de las proteínas purificadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la purificación fiable de proteínas secretadas con etiqueta polihistidina a partir de sobrenadantes bacterianos, lo que favorece la validación de objetivos en el descubrimiento de agentes antimicrobianos. El método ofrece un enfoque escalable para obtener proteínas de alta pureza destinadas a estudios funcionales y estructurales relacionados con factores de virulencia de Streptococcus mutans. Facilita la reducción mecanicista de riesgos al proporcionar rendimientos reproductibles de proteínas para el desarrollo de ensayos posteriores.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar factores de virulencia secretados, como las glucosiltransferasas, para la comprobación de hipótesis terapéuticas.
- Valor operativo: Proporciona proteína purificada para confirmar la interacción con el blanco y el mecanismo de acción en las primeras etapas del descubrimiento.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona una proteína antigénicamente pura adecuada para desarrollar ensayos de unión o inhibición.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante una calidad y concentración constantes de la proteína.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Permite el análisis estructura-función de objetivos purificados para orientar el diseño de inhibidores.
- Valor operativo: Proporciona material para la validación preclínica de la modulación del objetivo en modelos relevantes para la enfermedad.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco inicial, al proporcionar proteína purificada para la caracterización bioquímica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante ensayos funcionales que utilizan proteínas secretadas purificadas.
- Selección: Permite lecturas cuantitativas en ensayos de unión o enzimáticos que requieren proteínas de alta pureza.
- Análisis: Genera resultados medibles como rendimiento, pureza y actividad para tomar decisiones de avance o interrupción.
- Investigación Traducional: Conecta la validación del blanco con la evaluación preclínica mediante un suministro constante de proteínas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la purificación de proteínas secretadas con etiqueta de histidina procedentes de bacterias Gram-positivas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación del blanco al reducir la variabilidad proteica.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de precipitación, diálisis y cromatografía.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la producción confiable de proteínas para múltiples proyectos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de blancos basada en datos funcionales de proteínas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de purificación de proteínas y cromatografía.
- Necesita acceso a centrífugas, equipos de diálisis y sistemas de IMAC.
- Exige la estandarización de las condiciones de tampón entre equipos para obtener resultados reproducibles.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en los niveles de secreción al adaptarse a diferentes blancos proteicos.
- Limitado a proteínas que permanecen solubles y funcionales tras la precipitación con sulfato de amonio.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
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Última actualización: 29 agosto 2026