Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
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Tome una suspensión homogénea de caseum, el material necrótico rico en lípidos de las lesiones tuberculosas, que alberga micobacterias tolerantes a los medicamentos en su núcleo.
Agregue el fármaco de prueba al homogeneizado y al vórtice para facilitar su interacción con la matriz caseum.
Coloque un inserto de diálisis de equilibrio rápido, que contenga cámaras donante y receptora separadas por una membrana semipermeable, en la placa base.
Cargue el homogeneizado enriquecido con fármaco en la cámara donante y agregue tampón a la cámara receptora.
Selle la placa e incube con rotación.
Durante la incubación, el fármaco libre se difunde a través de la membrana, alcanzando el equilibrio entre ambas cámaras.
Una vez alcanzado el equilibrio, diluya la muestra del donante con tampón y la muestra del receptor con homogeneizado sin fármaco para normalizar las condiciones de la matriz para la cuantificación del fármaco.
Finalmente, cuantifique la concentración del fármaco y calcule la fracción del fármaco no unido o fu.
El fu refleja el fármaco libre disponible para difundirse en caseum y llegar a las micobacterias tolerantes a los fármacos.
Agregue 6,5 microlitros del compuesto de prueba preparado a 643,5 microlitros del homogeneizado. Lograr la concentración final de cinco micromolares y vórtice.
A continuación, coloque los insertos rojos en la placa base. Prepare los insertos para cada prueba, cada compuesto por triplicado.
Agregue 200 microlitros de la matriz enriquecida con fármaco en la cámara donante roja de cada inserto rojo. Luego, agregue 350 microlitros de PBS en cada cámara receptora.
Coloque un sello adhesivo en la placa e incube a 37 grados centígrados en el mezclador térmico a 200 rotaciones por minuto durante cuatro horas. Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras donante y receptora pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Transfiera 20 microlitros de homogeneizado de cada una de las cámaras donantes a 20 microlitros de PBS limpio en un tubo de 1,5 mililitros.
Del mismo modo, transfiera 20 alícuotas de microlitros de muestras de PBS de las cámaras receptoras a 20 microlitros de homogeneizado limpio.
La coincidencia de matrices elimina la necesidad de realizar dos curvas de visión de color separadas en homogeneizado y PBS para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donante puede sedimentarse con el tiempo. Mezcle suavemente el contenido pipeteando antes de retirar las alícuotas.