Microscopía microfluídica de lapso de tiempo para estudiar la persistencia de antibióticos en bacterias

Comience con células bacterianas de crecimiento exponencial que expresan una proteína de fusión de unión al ADN marcada con fluorescencia para visualizar el nucleoide.

Agregue las células a las entradas de células de una placa microfluídica preparada previamente.

A continuación, introduzca medios que contengan antibióticos y medios libres de antibióticos en entradas de solución separadas.

Selle la placa, móntela en la platina del microscopio e inicie imágenes de lapso de tiempo.

Primero, cargue las células en la cámara de cultivo.

Luego, perfunda medios libres de antibióticos en la cámara para apoyar el crecimiento celular exponencial.

Finalmente, introduzca los medios que contienen antibióticos.

El antibiótico induce roturas de ADN de doble hebra, matando células susceptibles. Estas células exhiben nucleoides compactados y no replicantes con fluorescencia estable.

Vuelva a cambiar a medios libres de antibióticos para promover la recuperación.

Las células persistentes, una pequeña subpoblación que sobrevive al tratamiento con antibióticos, reanudan la replicación del ADN, se alargan y se dividen.

Esta recuperación conduce a un aumento de la fluorescencia en las células persistentes, lo que les permite distinguirlas visualmente de las células susceptibles.

Retire la solución de conservación de cada pocillo de la placa microfluídica y reemplácela con un medio de cultivo nuevo. Selle la placa microfluídica con el sistema de colector haciendo clic en el botón Sellar o mediante el software microfluídico.

A continuación, en la interfaz del software microfluídico, realice una primera secuencia de cebado haciendo clic en Ejecutar secuencia de cebado líquido. Incube la placa en un gabinete del microscopio controlado termostáticamente a 37 grados Celsius durante un mínimo de dos horas antes de comenzar la obtención de imágenes de microscopía. Luego inicie una segunda secuencia de cebado líquido antes de comenzar el experimento.

Selle la placa microfluídica haciendo clic en Unseal Plate en la interfaz del software microfluídico. Reemplace el medio en los pocillos con 200 microlitros de medio fresco, medio fresco que contenga antibióticos y una muestra de cultivo diluida de 0,01 OD en el medio fresco. Después de sellar la placa microfluídica como se demostró anteriormente, coloque la placa en el objetivo del microscopio dentro de la cabina del microscopio.

En el software microfluídico, haga clic en Ejecutar secuencia de carga de celdas para permitir la carga de las células en la placa microfluídica. Establezca un enfoque óptimo utilizando el modo de luz transmitida y seleccione varias regiones de interés donde se pueda observar un número de celdas apropiado de hasta 300 celdas por campo. En el software microfluídico, edite Ejecutar una secuencia personalizada para programar la inyección de medio fresco a 6,9 kilopascales durante seis horas en los pocillos uno y dos, seguido del medio que contiene antibiótico a 6,9 kilopascales durante seis horas en el pozo tres, y finalmente el medio fresco a 6,9 kilopascales durante 24 horas en los pozos cuatro y cinco.

Realice imágenes de microscopía en modo de lapso de tiempo con un cuadro cada 15 minutos utilizando luz transmitida y la fuente de luz de excitación para el reportero fluorescente, e inicie el programa microfluídico. Abra el software ImageJ o Fiji en el equipo y arrastre las imágenes de microscopía de lapso de tiempo de hyperstack a la barra de carga de Fiji. Use Imagen, seguido de Color y, a continuación, Crear compuesto para fusionar los diferentes canales del hyperstack.

Utilice Imagen, Color y, a continuación, Organizar canales si los canales no se corresponden con el color deseado. Abra el complemento MicrobeJ y detecte las células bacterianas utilizando la interfaz de edición manual. Elimine las celdas detectadas automáticamente y delinee manualmente las celdas persistentes de interés cuadro por cuadro.

Después de la detección, utilice el icono Resultado en la interfaz de edición manual de MicrobeJ para generar una tabla ResultJ. Utilice la tabla ResultJ para obtener información sobre los diferentes parámetros de interés del análisis de una sola célula y guarde el archivo ResultJ.