Cribado de moduladores cíclicos de di-GMP utilizando bacterias que expresan una proteína indicadora fluorescente

Tome una placa de varios pocillos que contenga bacterias patógenas modificadas genéticamente cultivadas con diferentes compuestos de prueba, junto con controles negativos.

Las bacterias portan un plásmido con un gen que codifica la proteína verde fluorescente o GFP.

El promotor del gen es activado por una proteína que responde a las concentraciones cíclicas intracelulares de di-GMP o c-di-GMP.

Coloque la placa en un lector de placas.

Utilice el control negativo, que emite fluorescencia al máximo debido a la ausencia de un inhibidor de c-di-GMP, para ajustar la configuración para una medición óptima de la señal de fluorescencia.

Si un compuesto de prueba inhibe la formación de c-di-GMP, el nivel intracelular de c-di-GMP disminuye.

Los niveles reducidos de c-di-GMP desencadenan un cambio conformacional en la proteína, lo que lleva a la represión del promotor y a una baja expresión de GFP, lo que resulta en una disminución de la fluorescencia.

Mida la fluorescencia y analice los datos para identificar compuestos de prueba que modulan los niveles intracelulares de c-di-GMP en bacterias patógenas.

Aproximadamente 30 minutos antes de la medición espectrofotométrica, precaliente el lector de plac