Cuantificación de unidades formadoras de colonias de bacterias asociadas al intestino en moscas Drosophila

Comience con una microplaca que contenga homogeneizados preparados a partir de moscas Drosophila . Estas moscas albergaban una población controlada de una bacteria específica en su intestino.

Los homogeneizados contienen tejidos de mosca lisados y bacterias intestinales liberadas.

Aspire las bacterias suspendidas y diluya en serie en múltiples microplacas.

Detecte pequeños volúmenes de cada dilución en placas de agar, asegurándose de que las gotas permanezcan separadas.

Incubar para permitir que las bacterias proliferen en colonias visibles.

Capture imágenes de las placas para cuantificar las unidades formadoras de colonias (UFC), que representan el número de células bacterianas viables capaces de formar colonias individuales.

Con el software de análisis de imágenes, alinee cada imagen usando una línea de referencia, defina un límite y aplique una cuadrícula uniforme para segmentarla en zonas de conteo, cada una correspondiente a un solo punto.

Ajuste el umbral de brillo para distinguir las colonias individuales del fondo, luego ejecute el análisis para contar las colonias en cada punto y cuantificar las UFC.

Coloque tres placas de crecimiento rectangulares de agar MRS con las tapas abiertas en el gabinete de bioseguridad para que se sequen durante al menos 10 minutos. Prepare dos placas de dilución agregando 100 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos con una pipeta de 96 canales. Cargue una gradilla de puntas P-20 en la pipeta de 96 canales.

Realice una dilución 1:10 aspirando 11,1 microlitros de homogeneizado de la placa de muestra. Ahora, dispensarlo en la primera placa de dilución que contiene 100 microlitros de PBS estéril por pocillo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.

Mezcle nuevamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Transfiera 11,1 microlitros de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para cualquier dilución adicional. Para placas de localización, cargue dos microlitros de cada pocillo en la pipeta de 96 canales.

Baje el cabezal de la pipeta lentamente sobre la placa, evitando apuñalar el agar, y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas. Luego, verifique que las manchas de líquido penetren rápidamente en el agar y no se junten. Repita el proceso de recubrimiento para las placas de dilución restantes como se describe en el manuscrito.

Una vez que el líquido se haya absorbido completamente en el agar, invierta las placas e incube hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo. Organiza las placas de forma lógica y mantenlas en un orden específico mientras fotografías. Oriéntelos de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda para todas las placas.

Después de quitar la tapa de la placa, coloque la placa en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. Imagina las placas. Transfiera las imágenes a un ordenador y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y otros detalles pertinentes.

Organice las imágenes que se procesarán para la cuantificación en una carpeta. Los nombres de archivo que distinguen las placas se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos en la hoja de cálculo de salida. Crea subcarpetas denominadas Recortadas y Recibos en la carpeta.

Estas carpetas recibirán los archivos de salida. Ahora inicie el complemento Croptacular desde ImageJ y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar. Aparecerá un cuadro de diálogo para elegir la carpeta de origen.

Haga clic en Aceptar. Seleccione la carpeta de origen y haga clic en Abrir. A continuación, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo para elegir el directorio de destino. Seleccione la carpeta de destino y presione Abrir.

Si la imagen ya está recta, simplemente presione la barra espaciadora. De lo contrario, enderece la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debe volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen no aparece recta.

A continuación, dibuje un cuadro delimitador para el área de conteo y ajuste su tamaño y proporción hasta que todos los puntos estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de contorno para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.

Dado que el complemento asume que todas las fotos están alineadas de manera idéntica, asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera. Si esto es correcto, presione la barra espaciadora para continuar. De lo contrario, enderece la imagen como antes.

La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior. Ajuste si es necesario y presione Espacio. Inicie Count-On-It y seleccione Gridiron.

Establezca la intensidad de la colonia de umbral en función de un valor de intensidad de píxel superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible, sin dejar de seleccionar todas las colonias. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo Acción requerida cuando el umbral sea satisfactorio y, a continuación, haga clic en Aceptar para continuar.

En la primera imagen, se da la opción de continuar o volver al menú de configuración. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta Recibos creada anteriormente.

Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán el mismo umbral predeterminado que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para usar esta configuración o ajustar la configuración.