Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
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Comience con un cultivo de Neisseria gonorrhoeae cultivado en un medio sin metal.
La escasez de metales desencadena la expresión de transportadores de membrana externa que inician la absorción de metales cuando están disponibles.
Coloque una membrana de nitrocelulosa previamente empapada sobre papeles de filtro húmedos y ensamble el aparato de transferencia de puntos.
Detecte las células bacterianas y permita que el líquido se absorba.
Desmonte el aparato, retire la membrana y séquelo al aire.
Agregue un agente de bloqueo para evitar el enlace no específico.
Vuelva a insertar la membrana en el aparato, séllela con parafilm y vuelva a ensamblar.
Agregue un ligando de unión a metales derivado del huésped e incube agitando.
El ligando se une a los transportadores bacterianos.
Retire el líquido y lave la membrana para eliminar cualquier ligando no unido.
Agregue un anticuerpo primario específico del ligando, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con enzimas y un reactivo de detección colorimétrica que forme un producto coloreado.
Una señal visible indica la expresión de transportadores de metales bacterianos en condiciones limitadas por metales.
Después de la incubación de duplicación masiva, vuelva a diluir los cultivos con tres volúmenes de CDM. Luego, incube los cultivos a 37 grados centígrados agitando durante cuatro horas. Poco antes de la marca de las cuatro horas, corte tres trozos de papel de filtro y un trozo de nitrocelulosa al tamaño aproximado necesario para caber en un aparato de transferencia de puntos.
Remoje previamente la nitrocelulosa en agua desionizada durante unos 10 minutos antes de ensamblar el aparato con papel de filtro debajo de la nitrocelulosa. Al final de la incubación, registre las densidades celulares y estandarice las densidades a una densidad final adecuada. Luego, pipetee los cultivos celulares sobre la nitrocelulosa.
Cuando el papel de filtro haya absorbido todo el líquido, desmonte el aparato y deje que la mancha se seque. Bloquee la membrana de nitrocelulosa durante una hora con una solución de bloqueo adecuada y vuelva a montar el aparato de transferencia de puntos, reemplazando el papel de filtro con una película de parafina para crear un sello a prueba de fugas debajo de la nitrocelulosa. Diluya el ligando de unión al metal de interés a 0,2 micromolares en el bloqueador y sondee las células durante una hora con agitación moderada.
Al final de la incubación, sifone el líquido con una aspiradora, lave la transferencia y siga los procedimientos inmunológicos estándar para desarrollar la señal.