Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:38 min. • October 30th, 2025
Tome un cultivo de Mycobacterium smegmatis que alberga genes inducibles para GFP y una luciferasa mutante marcada con señales de secreción.
El gen mutante codifica una luciferasa inactiva, pero la mala traducción natural durante la síntesis de proteínas produce una enzima activa.
La GFP sirve como control interno para normalizar la expresión de luciferasa.
Agregue el inductor para iniciar la expresión génica, luego alícuota el cultivo en una placa de múltiples pocillos.
Introducir concentraciones crecientes de una molécula de prueba en pocillos seleccionados. Incubar.
En condiciones de control, la traducción errónea da como resultado una secreción activa de luciferasa.
Si la molécula de prueba inhibe la traducción incorrecta, la secreción activa de luciferasa disminuye.
Transfiera las alícuotas de cultivo a una placa negra y mida la fluorescencia de GFP.
Centrifugar para peletizar las células.
Transfiera los sobrenadantes que contienen luciferasa secretada y agregue el sustrato, donde la luciferasa activa cataliza su oxidación, produciendo luminiscencia.
Mida la luminiscencia y calcule la relación Luciferasa/GFP; una proporción más baja indica una reducción de la traducción errónea debido a la molécula de prueba.
Para comenzar, inocular dos mililitros de medio 7H9 con la cepa reportera bacteriana.
Agite a 37 grados Celsius durante uno o dos días o hasta que el OD a 600 nanómetros alcance la fase estacionaria.
Luego, subcultive en 50 mililitros de medio 7H9 y crezca hasta que el OD a 600 nanómetros alcance la fase estacionaria tardía. Antes de alícuotas de las bacterias a una placa de 96 pocillos, agregue ATC a una concentración final de 50 nanogramos por mililitro y mezcle bien.
Agregue 100 microlitros por pocillo a una placa transparente de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, agregue diferentes dosis de Ksg a los pocillos seleccionados para evaluar sus efectos sobre las tasas de traducción incorrecta. Agregue 200 microlitros de agua estéril a los pocillos de borde de la placa para limitar la evaporación de los pocillos de muestra.
Selle la placa, agite e induzca las muestras a 37 grados centígrados durante 16 a 20 horas. Utilice una pipeta multicanal para tomar 80 microlitros de cada pocillo. Transfiera las muestras a una placa de 96 pocillos de fondo negro y mida la señal GFP con el luminómetro.
Después de medir la señal GFP, centrifugar la placa a 3.220 veces g durante 10 minutos. Luego, transfiera 50 microlitros del sobrenadante a una placa de 96 pocillos de fondo blanco.
Luego, agregue 50 microlitros de sustrato Nluc a cada pocillo, mezcle bien y mida la luminiscencia con el luminómetro. Finalmente, determine la relación Nluc / GFP dividiendo el valor de luminiscencia Nluc corregido por la fluorescencia GFP.