Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:38 min. • October 30th, 2025
Tome un cultivo de Mycobacterium smegmatis que alberga genes inducibles para GFP y una luciferasa mutante marcada con señales de secreción.
El gen mutante codifica una luciferasa inactiva, pero la mala traducción natural durante la síntesis de proteínas produce una enzima activa.
La GFP sirve como control interno para normalizar la expresión de luciferasa.
Agregue el inductor para iniciar la expresión génica, luego alícuota el cultivo en una placa de múltiples pocillos.
Introducir concentraciones crecientes de una molécula de prueba en pocillos seleccionados. Incubar.
En condiciones de control, la traducción errónea da como resultado una secreción activa de luciferasa.
Si la molécula de prueba inhibe la traducción incorrecta, la secreción activa de luciferasa disminuye.
Transfiera las alícuotas de cultivo a una placa negra y mida la fluorescencia de GFP.
Centrifugar para peletizar las células.
Transfiera los sobrenadantes que contienen luciferasa secretada y agregue el sustrato, donde la luciferasa activa cataliza su oxidación, produciendo luminiscencia.
Mida la luminiscencia y calcule la relación Luciferasa/GFP; una proporción más baja indica una reducción de la traducción errónea debido a
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