Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:44 min. • October 30th, 2025
Tome un gel SDS-PAGE que contenga bandas de proteínas de partículas de nanolipoproteínas de membrana. Estos complejos transportan la proteína de membrana oligomérica de Chlamydia o MP, un antígeno de vacuna prometedor contra la infección por Chlamydia .
Utilice bandas de proteínas de MP oligomérico purificado como control.
Ensamble el gel, la membrana Western Blot y los componentes secantes en un sistema de transferencia en seco.
Aplique una corriente eléctrica para transferir las proteínas resueltas a la membrana.
Retire la membrana e incube en un tampón que contenga detergentes y anticuerpos primarios.
Los detergentes bloquean los sitios de interacción no específicos, mientras que los anticuerpos primarios se dirigen al MP.
Lave la membrana para eliminar los anticuerpos primarios no unidos.
Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos dirigidos a los anticuerpos primarios.
Lave la membrana para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.
Capture imágenes de fluorescencia de la membrana.
Las bandas moleculares que coinciden con el MP oligomérico de control confirman la integridad estructural del MP dentro de los complejos, lo que respalda su potencial antigénico.
Resuelva las muestras mediante SDS-PAGE y transfiera las pilas de gel utilizando un sistema comercial de transferencia seca para el análisis de Western blot. Retire las manchas de la pila e incube durante la noche a cuatro grados Celsius en un tampón de bloqueo que contenga 0,2% TWEEN 20 y 0,5 microgramos por mililitro MAb40, o 0,2 microgramos por mililitro de anticuerpo MAbHIS antiHIS-tag dirigido contra el HIS-tag de la proteína delta-49ApoA1.
Lave cada transferencia con PBST tres veces durante cinco minutos por lavado. Incube las transferencias durante una hora en un tampón de bloqueo que contenga un anticuerpo secundario conjugado con un fluoróforo en una dilución de 1 a 10.000. Repita los lavados con PBST y capture la imagen con un generador de imágenes de fluorescencia después del lavado final.