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Microbiología
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Comience con un cultivo de cianobacterias, que son bacterias fotosintéticas.
Estas bacterias contienen gotas de plastoglóbulos ricos en lípidos y membranas tilacoides, que son estructuras membranosas plegadas ricas en pigmentos fotosintéticos.
Centrifugar el cultivo y desechar el sobrenadante para eliminar los polisacáridos extracelulares producidos por bacterias. Lave el gránulo y luego vuelva a suspenderlo en un tampón.
Utilice un homogeneizador de alta presión para generar fuerza de cizallamiento, que altera las paredes celulares y las membranas.
La ruptura de las membranas tilacoides libera pigmentos fotosintéticos en el lisado. La liberación de pigmento provoca un cambio de color que indica la alteración celular y la liberación de plastoglóbulos.
Cargue el lisado en tubos de centrífuga, luego agregue una solución de sacarosa para formar un gradiente de densidad.
Centrifugar para separar los componentes celulares por densidad.
El tilacoide y otros componentes más pesados se perdigan en la parte inferior, mientras que los plastoglóbulos de baja densidad flotan hacia la parte superior como una banda distinta.
Recoja la fracción de plastoglóbulos y guárdela congelándola para su posterior análisis.
Cultivar 50 mililitros de cultivo de especies de synechocystis PCC 6802 en medios BG11 durante 7 a 10 días para alcanzar la fase estacionaria.
Con un espectrofotómetro, ajuste la densidad celular a una densidad óptica de 2.0 a 750 nanómetros. Para eliminar los polisacáridos, centrifugar 50 mililitros de cultivo y eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de las células en 50 mililitros de tampón A dos veces.
Vuelva a suspender el gránulo lavado en 25 mililitros de tampón A y rompa las celdas usando una celda de presión francesa a 1,100 libras de pulgadas cuadradas. Repita el proceso tres veces en condiciones frías hasta que el color lisado cambie de verde a rojo-azul-verde bajo luz blanca. Retire la alícuota del homogeneizado celular y déjela a un lado para almacenarla como una muestra celular total representativa.
Distribuya el homogeneizado resultante en ocho tubos de ultracentrífuga de tres mililitros llenos hasta un máximo de 2,5 mililitros en cada tubo. Superponga este homogeneizado con 400 microlitros de R medio, produciendo un gradiente escalonado. Equilibre cuidadosamente los tubos agregando medio R adicional según sea necesario antes de centrifugar los tubos.
El tilacoide y otros orgánulos más pesados, incluidos los cuerpos de polihidroxialcanoato, muestran formación de gránulos, mientras que los plastoglóbulos forman una almohadilla aceitosa amarilla en o cerca de la parte superior del gradiente de sacarosa. Coseche la almohadilla flotante resultante de plastoglóbulos crudos con una jeringa y deposite la cosecha en un tubo de dos mililitros.
Raspe los plastoglóbulos del costado de la pared del tubo de ultracentrífuga con la punta de una aguja si es necesario. Continúe con el procesamiento de cianobacterias o almacene los plastoglóbulos crudos a menos 80 grados centígrados y purifique más tarde.