Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
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Comience con gusanos adultos de C. elegans libres de gérmenes suspendidos en el medio.
Introducir la bacteria de prueba e incubar.
A medida que los gusanos se alimentan, las bacterias ingresan a la luz intestinal y se adhieren al epitelio.
Centrifugar para peletizar los gusanos y eliminar las bacterias no ingeridas.
Vuelva a suspender en tampón, centrifugar y eliminar las bacterias restantes no ingeridas.
Agregue medios que contengan E. coli muerta por calor e incube.
Durante la alimentación, la E. coli muerta por calor desplaza y expulsa las bacterias de prueba no adheridas de la luz intestinal.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante que contiene las bacterias expulsadas.
Lavar con tampón, centrifugar y eliminar el sobrenadante.
Enfríe los gusanos en hielo para inducir parálisis, evitando una mayor ingestión.
Agregue una solución de lejía e incube para matar las bacterias externas residuales.
Retire la lejía y agregue un tampón frío.
Centrifugar y eliminar el sobrenadante para eliminar la lejía residual.
Los gusanos ahora retienen solo bacterias de prueba viables adheridas al epitelio intestinal, lo que permite la cuantificación de la colonización.
Comience resuspendiendo la muestra de gusano en un mililitro de M9TX-01 en un tubo de microcentrífuga. Recoge los gusanos adultos por centrifugación y desecha el sobrenadante. Usando los mismos parámetros de centrifugación, enjuague los gusanos dos veces con un mililitro de M9TX-01 y una vez con un mililitro de tampón de gusanos M9 para minimizar las bacterias externas. Luego, vuelva a suspender cada muestra en un mililitro de medio S más 2X OP50 muerto por calor en un tubo de cultivo. Incube los tubos a 25 grados centígrados durante 20 a 30 minutos para eliminar las bacterias no adheridas del intestino.
Después de la incubación, enjuague los gusanos purgados dos veces con un mililitro de M9TX-01 frío y deseche el sobrenadante. Ponga los tubos en hielo durante 10 minutos para paralizar los gusanos. Luego, agregue un mililitro de tampón de gusano M9 helado con lejía sin perfume a cada tubo.
Incube los tubos en hielo durante un mínimo de 10 minutos para matar las bacterias externas. Deseche el tampón de lejía y devuelva los tubos al hielo para evitar que los gusanos bombeen. A continuación, agregue un mililitro de M9TX-01 frío a cada tubo y centrifugue durante cinco segundos en una mini centrífuga. Vuelva a colocar los tubos en hielo y retire el sobrenadante. Repita este paso una vez.