Transformación natural y expresión de GFP en la cianobacteria filamentosa Phormidium lacuna

Tome un cultivo de Phormidium lacuna, una cianobacteria filamentosa.

Homogeneizar el cultivo para dispersar los filamentos, luego centrifugar para granular las bacterias.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en un medio rico en nutrientes.

Agregue ADN plasmídico que contenga proteína fluorescente verde y genes de resistencia a los antibióticos en una placa de agar suplementada con antibióticos.

Agregue la suspensión bacteriana sobre el ADN e incube en condiciones de luz.

Las bacterias internalizan el ADN utilizando pili tipo IV. Los genes introducidos se integran en una de las múltiples copias del genoma bacteriano.

Redistribuya las bacterias en una placa de agar suplementada con antibióticos para seleccionar las bacterias transformadas.

Bajo un microscopio óptico, identifique filamentos verdes sanos que indiquen una transformación exitosa.

Transfiera los filamentos seleccionados a medios líquidos con una mayor concentración de antibióticos para enriquecer la población transformada.

Nuevamente, colóquelos en agar con niveles más altos de antibióticos para segregar transformadores.

Visualice la expresión de GFP bajo un microscopio de fluorescencia para confirmar una transformación exitosa.

Comience inoculando 50 mililitros de medio líquido F2 en cada uno de los dos matraces de 250 mililitros con un mililitro de filamentos de P. lacuna de un cultivo continuo. Cultivar con luz blanca bajo agitación durante unos cinco días a 25 grados centígrados.

Después de cinco días, homogeneizar 100 mililitros de suspensión celular de P. lacuna a 10,000 RPM durante tres minutos y medir la densidad óptica a 750 nanómetros. A continuación, centrifugar la suspensión celular durante 15 minutos a 6.000 veces g. Retire el sobrenadante y suspenda el sedimento en 800 microlitros del líquido restante y medio F2+ adicional. Tome ocho placas de agar Bacto F2+ que contengan 120 microgramos por mililitro de kanamicina y pipetee 10 microgramos de ADN en el centro de cada placa de agar.

Pipetear inmediatamente 100 microlitros de la suspensión celular sobre el ADN. Mantenga la placa de agar sin tapa en el banco limpio para permitir que el exceso de líquido se evapore. Cierre el plato y cultívelo con luz blanca a 25 grados centígrados durante dos días.

Después de dos días, distribuya los filamentos de cada placa de agar en varias placas frescas de agar F2+ Bacto que contengan 120 microgramos por mililitro de kanamicina con un asa de inoculación. Cultive las placas con luz blanca a 25 grados centígrados y revise los cultivos regularmente bajo un microscopio. Después de 14 a 28 días, identifique los filamentos marrones muertos y busque filamentos transformados bajo el microscopio.

Los filamentos transformados se ven sanos y verdes y son diferentes de la mayor parte de los filamentos. Transfiera cada filamento transformado a matraces de 50 mililitros con 10 mililitros de medio F2+ con 250 microgramos por mililitro de kanamicina. Cultive con luz blanca a 25 grados centígrados en una coctelera y observe el crecimiento hasta por cuatro semanas.

Transfiera los filamentos nuevamente al medio de agar que contiene 250 microgramos por mililitro de kanamicina y espere a que los filamentos crezcan. Luego, aumente la concentración de kanamicina nuevamente para acelerar la segregación. Para la expresión de GFP, observa filamentos individuales con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 40X o 63X y captura una imagen de transmisión de campo claro y una imagen de fluorescencia.