Generación de mutantes marcados con antibióticos en cianobacterias mediante recombinación homóloga

Comience con un cultivo de cianobacterias.

Centrifugar el cultivo, luego lavar suavemente el gránulo para preservar la superficie bacteriana pili.

Centrifugar nuevamente, volver a suspender el gránulo en medio fresco y transferir a un tubo.

Introducir un vector no replicante con un gen de resistencia a los antibióticos. Este gen está flanqueado por secuencias de ADN que son homólogas a las regiones ubicadas aguas arriba y aguas abajo de un gen diana en el genoma bacteriano.

Incubar para permitir la internalización mediada por pili del plásmido, que se alinea con las secuencias homólogas y reemplaza el gen diana a través de la recombinación, introduciendo así una mutación.

Esparce las células en agar e incuba, permitiendo que el gen de resistencia a los antibióticos exprese una proteína de resistencia.

Cubra la superficie del agar con agar que contenga un antibiótico e incube. La proteína de resistencia en las células mutantes inactiva el antibiótico, facilitando su supervivencia y la formación de colonias.

Elija las colonias supervivientes y vuelva a aplicar agar que contenga un antibiótico para segregar los mutantes resistentes a los antibióticos.

Después de preparar los medios, las cepas