Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
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Comienza con un tubo que contiene gusanos C. elegans .
Transfiere los gusanos a una placa multipozo con un medio de agarosa rico en nutrientes que contenga la bacteria de control o la bacteria de prueba.
Durante la incubación, los gusanos ingieren bacterias, que colonizan el epitelio intestinal y liberan aminoácidos que sirven como fuente de nutrientes. Estos aminoácidos se metabolizan en derivados de aminoácidos y se almacenan en gránulos intestinales relacionados con los lisosomas.
A continuación, añade un nuevo tampón y transfiere los gusanos a una placa negra de ensayo multipozo.
Añade un inductor químico de estrés a cada pozo y sella la placa.
Coloca la placa en un lector de placas de fluorescencia y registra la fluorescencia.
En los gusanos, el inductor de estrés provoca estrés oxidativo, que daña las células epiteliales intestinales.
Esto provoca que los gránulos intestinales relacionados con los lisosomas se rompan, liberando derivados de aminoácidos que, al exponerse a la luz ultravioleta, se fluorescen en azul.
Comparar la fluorescencia de los gusanos expuestos a las bacterias de control y de prueba para evaluar la eficiencia de colonización bacteriana y su impacto en la respuesta al estrés oxidativo del huésped.
Ajusta la concentración de gusanos a 15 gusanos por microlitro en el tubo cónico de 15 mililitros. Luego, transfiere 8 microlitros de solución de gusillo a cada uno de los pozos de las ocho placas de agarosa NGM de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal o pipeta de repetición.
Tras 36 horas, dispensar 30 microlitros de M9 en cada pozo de la placa de 96 pozos. A continuación, transferir los gusanos a la placa de 384 pozos según los diseños de los conjuntos usando puntas de baja retención, asegurando que los lectores de placas estén correctamente ajustados. Después, se rellenan las placas de 384 pozos con más M9, buscando un volumen final de 60 microlitros por pozo añadiendo 40 microlitros de M9 para el ensayo de estrés térmico y 34 microlitros de M9 en 6 microlitros de TBHP para el estrés oxidativo inducido por TBHP.
Luego, empieza el ensayo en los dos minutos siguientes a añadir TBHP. A continuación, cierra las placas con su tapa transparente y sella los bordes de las placas de 384 pozos con cinta de enmascarado, asegurando que la cinta no pase por encima de la tapa ni por debajo de la placa. Luego, inserta la placa en el lector de placas.