Una técnica de cromatografía de afinidad para la purificación de una proteína bacteriana recombinante

Toma una suspensión de células bacterianas que expresan una proteína objetivo marcada con polihistidina.

Sonica sobre hielo para minimizar la degradación de proteínas. Las ondas sonoras de alta frecuencia lisan las células, liberando contenido intracelular, incluida la proteína objetivo.

Centrifugar para separar los restos y transferir las proteínas que contienen el sobrenadante a una jeringuilla.

Filtra el sobrenadante para eliminar los agregados y evitar obstrucciones en la columna de cromatografía.

Toma una columna de cromatografía de afinidad basada en níquel y equísala para una purificación óptima de proteínas.

Carga el filtrado sobre la columna. La etiqueta de polihistidina se une a iones níquel en la resina columna, inmovilizando las proteínas objetivo.

Lava la columna con un tampón para eliminar las proteínas no unidas y monitoriza la absorción UV del eluato para confirmar la eliminación de proteínas no objetivo.

Añade un tampón de elución que contenga imidazol, que compite con la etiqueta de polihistidina para unirse al níquel, liberando las proteínas.

Un segundo pico en la absorbancia UV confirma la elución de la proteína objetivo, que está lista para su uso aguas abajo.

Sonica la