$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toma una suspensión de células bacterianas que expresan una proteína objetivo marcada con polihistidina.
Sonica sobre hielo para minimizar la degradación de proteínas. Las ondas sonoras de alta frecuencia lisan las células, liberando contenido intracelular, incluida la proteína objetivo.
Centrifugar para separar los restos y transferir las proteínas que contienen el sobrenadante a una jeringuilla.
Filtra el sobrenadante para eliminar los agregados y evitar obstrucciones en la columna de cromatografía.
Toma una columna de cromatografía de afinidad basada en níquel y equísala para una purificación óptima de proteínas.
Carga el filtrado sobre la columna. La etiqueta de polihistidina se une a iones níquel en la resina columna, inmovilizando las proteínas objetivo.
Lava la columna con un tampón para eliminar las proteínas no unidas y monitoriza la absorción UV del eluato para confirmar la eliminación de proteínas no objetivo.
Añade un tampón de elución que contenga imidazol, que compite con la etiqueta de polihistidina para unirse al níquel, liberando las proteínas.
Un segundo pico en la absorbancia UV confirma la elución de la proteína objetivo, que está lista para su uso aguas abajo.
Sonica las células sobre hielo usando cinco ciclos de un pulso de 15 segundos y una pausa de 30 segundos.
Tras centrifugar el lisado celular a 21.000 g y cuatro grados Celsius durante 15 minutos, filtrar el sobrenadante usando un sistema de filtro con jeringuilla estéril. Utiliza un sistema automatizado de purificación, equipado con una columna de afinidad de cinco mililitros basada en níquel para purificar la fracción de RTA marcada con HIS del sobrenadante estéril filtrado por E. coli. En general, utiliza una velocidad de elución de un mililitro por minuto y enfría todo el sistema de purificación para evitar la unión ineficiente de toxinas y la pérdida de su actividad.
Equilibrar brevemente la columna de afinidad con 20 mililitros de buffer de unión para eliminar el buffer de almacenamiento. Luego, aplica el sobrenadante estéril y filtrado sobre la columna de afinidad usando una jeringuilla. Lava la columna con 25 a 35 mililitros de tampón de unión para eliminar las proteínas no unidas de la columna.
Realiza el paso de lavado hasta que la absorbancia UV a 280 nanómetros esté cerca del valor inicial de UV. Luego, eluye la fracción unida de RTA con 20 a 35 mililitros de tampón de elución y mantenga la muestra en hielo. Es importante comenzar el muestreo de la fracción RTA poco después de que aumente el valor de UV 280 y detener el muestreo de la fracción RTA cuando vuelva a alcanzar la línea base original.