Aislamiento de endósporas de una muestra ambiental mediante lisis dirigida de células vegetativas

Toma una muestra ambiental que contenga células vegetales y endosporas de una bacteria formadora de endosporas, junto con otras bacterias.

Las endosporas tienen una capa protectora que les ayuda a sobrevivir en condiciones adversas.

Utilizando una unidad de filtración al vacío, filtra la muestra para atrapar las células y endósporas en una membrana.

Coloca la membrana en un plato y córtala en trozos pequeños.

Transfiere los fragmentos a un tubo, añade un amortiguador y agita el tubo para liberar las células y las endosporas.

Incubar con agitación a alta temperatura para debilitar las estructuras celulares vegetales sin dañar las endosporas.

Enfría la muestra, luego añade la lisozima e incuba con agitación. La lisozima altera la pared celular de las células vegetativas, provocando su ruptura.

Añade hidróxido de sodio y un detergente, e incuba para degradar las macromoléculas celulares y los restos, preservando las endósporas resistentes.

Filtra la muestra para aislar las endósporas. Lava las endosporas para eliminar el exceso de reactivos, preparándolas para un análisis posterior.

Una vez que la unidad de filtración y la bomba de vacío han sido preparadas según el protocolo de texto, se utilizan pinzas esterilizadas con flama de etanol para añadir membrana de nitrocelulosa estéril a la unidad de filtración. Añade la mitad de la muestra de sobrenadante recién preparada sobre la unidad de filtración de membrana y utiliza la bomba de vacío para recoger las células de la membrana. Cuando el líquido haya pasado completamente por el filtro, detiene la bomba de vacío.

Utiliza pinzas esterilizadas para retirar cuidadosamente la membrana y colócala en una placa de Petri estéril. Con un trozo nuevo de membrana estéril, repite la filtración con la mitad restante de la solución. Para separar las endosporas de las células vegetales de la biomasa recién recogida, descongelar la membrana si está congelada y usar tijeras esterilizadas con flama de etanol para cortarla en trozos más pequeños.

Transfiere las piezas de membrana a un tubo estéril de dos mililitros y añade 900 microlitros de buffer 1X TE. Mezcla bien mediante vórtices para liberar la biomasa de la membrana. Incuba el tubo a 65 grados Celsius y 80 RPM durante 10 minutos.

Luego, retira el tubo de la incubadora y déjalo enfriar durante 15 minutos. Añade 100 microlitros de lisozima recién preparada a una concentración final de dos miligramos por mililitro e incuba la muestra a 37 grados Celsius y 80 RPM durante 60 minutos para lisar las células vegetales. Una vez completada la lisis, añadir 250 microlitros de 3 soluciones normales de hidróxido de sodio y 250 microlitros de solución SDS al 6% a la muestra. Incuba a temperatura ambiente y a 80 RPM durante 60 minutos.

A continuación, prepara una unidad de filtración estéril que contenga membranas de 25 milímetros de diámetro mediante autoclav. Después de que la unidad de filtración se enfríe, coloque sobre ella una membrana de nitrocelulosa de 25 milímetros de diámetro y 0,2 micrómetros.

Añade la muestra a la membrana y utiliza la bomba de vacío para filtrar el líquido, capturando las endósporas en la membrana, mientras el material celular vegetativo pasa a través de ella.