Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:09 min. • November 28th, 2025
Tomemos un cultivo de E. coli modificado genéticamente que expresa una matriz operadora de tetraciclina cromosómica (tetO).
Las bacterias también portan un plásmido con un promotor inducible por arabinosa que impulsa la expresión de la proteína represora tetraciclina marcada con YFP.
Transfiere el cultivo a un medio nutritivo enriquecido que contenga antibióticos e incuba con agitación para seleccionar células que contienen plásmidos.
A medida que las células crecen, se forman los reresponsomas que inician la replicación cromosómica del ADN.
En la fase exponencial, recoge una porción como control no inducido.
Añade arabinosa, un inductor, al cultivo restante e incuba ambos cultivos con agitación.
En el cultivo no inducido, el dímero de AraC permanece unido al lazo de ADN, inhibiendo la expresión de los represores.
En el cultivo inducido, la arabinosa se une al dímero AraC, induciendo la expresión del represor.
Las proteínas represoras se unen al conjunto cromosómico tetO, deteniendo la progresión de la horquilla de replicación.
Utiliza microscopía de fluorescencia para observar ambos cultivos.
Los focos fluorescentes en el cultivo inducido de E. coli confirman la obstrucción de replicación mediada por proteínas represoras.
Para este procedimiento se utiliza una cepa de E. coli que transporta un arreglo de operadores de tetraciclina en el plásmido pKM1. pKM1 codifica TetR-YFP, una proteína represora de tetraciclina marcada con proteína fluorescente amarilla inducible.
Diluir un cultivo fresco durante la noche de esta cepa de E. coli hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,01 en un medio complejo diluido con antibióticos según sea necesario para la selección. Cultivar el cultivo a 30 grados Celsius con agitación hasta una densidad óptica de 600 nanómetros de 0,05 a 0,1. Retira una muestra de 10 mililitros para que sirva como control no inducido.
Añadir un 0,01% de arabinosa al cultivo restante para inducir la producción de TetR-YFP a partir de pKM1. Sigue cultivando tanto los cultivos no inducidos como los inducidos a 30 grados Celsius con agitación. Tras una hora, comprueba la presencia de un único punto focal dentro de cada célula del cultivo inducido mediante microscopía de fluorescencia.
Si se confirma que las células inducidas están bloqueadas, lo que indica que más del 70% de las células tienen un único foco, se registra la densidad óptica y se extraen 7,5 mililitros de la muestra para su análisis mediante electroforesis en gel bidimensional. Retirar una muestra equivalente del cultivo de control no inducido.