JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:48 min • November 28th, 2025
Toma una mezcla maestra que contiene una ADN polimerasa desplazante de cadena, nucleótidos y un colorante de unión al ADN de doble cadena para amplificación isotérmica mediada por lazo o LAMP.
Añade cebadores que contengan una secuencia complementaria inversa específica del gen bacteriano objetivo.
Distribuye la mezcla maestra en los tubos.
Añade muestras que contengan plantillas de ADN bacteriano a los tubos.
Coloca los tubos dentro de un instrumento LAMP.
La desnaturalización inicial permite que el cebador se una al ADN objetivo.
A medida que la ADN polimerasa desplazante de cadena comienza a sintetizar una nueva hebra, desplaza la cadena existente, eliminando la necesidad de ciclos térmicos.
El producto amplificado forma una estructura en bucle debido al emparejamiento complementario inverso.
Esta estructura contiene múltiples puntos de inicio para el siguiente ciclo, facilitando la amplificación exponencial del ADN objetivo.
El tinte se une al ADN amplificado y emite fluorescencia.
Monitoriza la fluorescencia en tiempo real para detectar la presencia del gen bacteriano objetivo en las muestras.
Separa físicamente las áreas utilizadas para preparar la mezcla maestra LAMP y añadir las plantillas de ADN.
Limpia las superficies de trabajo con isopropanol y una solución degradante de ADN y DNasa. Luego, limpia las pipetas y los portatubos para tiras. Descongela la mezcla maestra isotérmica, la mezcla de imprimación 10X, agua de grado molecular, ADN de control positivo y plantillas de ADN a temperatura ambiente.
Enciende el instrumento LAMP e introduce la información de muestra relevante. Prepara la mezcla maestra LAMP según las instrucciones del manuscrito, centrifuga brevemente y distribuye 23 microlitros de la mezcla maestra en cada pozo de una tira de tubos. Haz un vórtice en todas las plantillas de ADN y centrifugalas brevemente.
Luego, añade dos microlitros de plantilla de ADN al pozo correspondiente y tapa bien el pozo. Quita la tira del tubo del soporte y dale un golpe para asegurarte de que todos los reactivos se han acumulado en el fondo del tubo. Carga la tira de tubos en el instrumento LAMP y comienza la secuencia LAMP.
Mientras la reacción LAMP está en curso, pulsa las pestañas Temperatura, Amplificación y Recocido para observar los cambios dinámicos de varios parámetros durante la ejecución del LAMP.