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Microbiología
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Comienza con un cultivo de Myxococcus xanthus, una bacteria del suelo de crecimiento lento.
Inocular una colonia en un medio suplementado con antibiótico.
Las células han sido diseñadas para resistir el antibiótico, asegurando que solo sobrevivan las bacterias deseadas.
Transfiere la suspensión a un matraz más grande que contenga el medio e incuba agitando para favorecer un crecimiento óptimo.
Toma una funda de cubierta montada en un marco metálico, que proporciona soporte mecánico durante la imagen.
Dispensa el cultivo bacteriano sobre él y luego añade microsferas fluorescentes para servir como puntos de referencia para la alineación de imágenes mientras se adquieren múltiples imágenes.
Coloca una almohadilla de agarosa precalentada que contiene el medio y luego enciéndela con una capa de cobertura para mantener la hidratación.
Incuba para que las células se adhieran a la almohadilla de agarosa.
La almohadilla suministra nutrientes a las células, permitiendo la obtención de imágenes a largo plazo de los procesos celulares durante la proliferación en la bacteria de crecimiento lento.
Para empezar, resuspende una sola colonia de M. xanthus en 500 microlitros de CTT al 1%, suplementada con antibióticos, en un tubo estéril y transfiere toda la suspensión a un matraz Erlenmeyer de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de CTT al 1%. Preparar una solución microscópica de agarosa al 1% que contenga 0,2% de CTT mezclando un gramo de agarosa con 80 mililitros de tampón TPM y 20 mililitros de medio CTT al 1%. Cocina la solución en el microondas hasta que la agarosa esté fundida.
Llena una placa de Petri con aproximadamente 60 mililitros de agarosa fundida y déjala enfriar hasta temperatura ambiente. Precalienta la almohadilla de agarosa a 32 grados Celsius durante al menos 15 minutos antes de usarla. Después, coloca una funda de cristal estéril sobre un marco de plástico o metal que tenga un agujero en el centro. Luego usa cinta adhesiva para fijar el vestivestidor al marco.
Añade de 10 a 20 microlitros de células de M. xanthus crecidas exponencialmente sobre la capa de cobertura. Para añadir microesferas fluorescentes como marcadores fiduciales de las células, se utiliza el tampón TPM para diluir las microesferas a 1:100. Sacude bien la suspensión de tallas y añade entre cinco y diez microlitros a las celdas.
De la almohadilla grande y precalentada al 1% de agarosa, corta una almohadilla pequeña del tamaño aproximado de la capa de la cubierta y colócala sobre las celdas. Luego coloca una cubierta sobre la almohadilla para evitar la evaporación y mantener las células en un ambiente húmedo. Incubar la muestra de microscopía a 32 grados Celsius durante 15 a 20 minutos para que las células se adhieran al fondo de la almohadilla de agarosa antes de los registros de microscopía en time-lapse.