Evaluación del papel protector de una chaperona activada por ácido en E. coli bajo estrés ácido

Tomemos cultivos recombinantes de E. coli sensibles al estrés ambiental.

El cultivo de prueba lleva un plásmido que codifica un acompañante activado por ácido, mientras que el cultivo de control solo lleva la columna vertebral del plásmido.

Inocular las colonias individuales en medios suplementados con antibióticos para asegurar la retención de plásmidos e incubar para promover el crecimiento bacteriano.

Diluir los cultivos en medios frescos que contengan el antibiótico y un inductor para activar la expresión de chaperonas.

Cultivar los cultivos hasta la fase media logarítmica y luego diluir para alcanzar una densidad óptica específica.

Añade ácido para bajar el pH, induciendo estrés ácido.

En el cultivo de prueba, las condiciones ácidas activan la chaperona, que estabiliza las proteínas celulares y previene su agregación. En el cultivo control, la ausencia de la chaperona provoca que las proteínas celulares se desnaturalicen y se agreguen.

Añade una base para neutralizar el pH y detener el estrés ácido.

Monitoriza el crecimiento bacteriano midiendo la densidad óptica a lo largo del tiempo.

El aumento del crecimiento en el cultivo de prueba indica el papel protector del acompañante durante el estrés ácido.

Prepara un cultivo nocturno en 50 mililitros de LB con ampicilina y cultiva las células a 200 RPM y 30 grados Celsius. Diluye los cultivos nocturnos 40 veces hasta 25 mililitros de LB con ampicilina.

Cultivar la bacteria en presencia de 0,5% de arabinosa a 30 grados Celsius y 200 RPM hasta una densidad óptica de 600 nanómetros, o_{un OD 600} igual a 1,0, para inducir la expresión de proteínas HDEB. Para los experimentos de cambio de pH, utiliza LB con ampicilina y arabinosa para diluir las células a un OD₆₀₀ de 0,5. Ajusta a los valores de pH respectivos añadiendo volúmenes apropiados de ácido clorhídrico de cinco molares.

Tras los tiempos indicados, neutraliza los cultivos añadiendo los volúmenes adecuados de hidróxido de sodio de cinco molares. Monitoriza el crecimiento de los cultivos neutralizados y el cultivo líquido durante 12 horas a 30 grados Celsius utilizando mediciones de OD.