Extracción de ADN genómico de tejido foliar vegetal infectado con bacterias patógenas

Toma una hoja infectada con Candidatus liberibacter, una bacteria patógena.

Córtala en trozos, congela rápidamente en nitrógeno líquido y muélila para romper las células vegetales y liberar su contenido, incluidas las bacterias.

Añade un buffer de lisis de núcleos y mezcla bien.

Incubar a alta temperatura para lisar las membranas, liberando ADN genómico de los núcleos de las plantas y células bacterianas.

Añade enzima RNasa, invierte el tubo para mezclarlo e incuba para degradar ARN.

Añade una solución de precipitación de proteínas y mezcla para favorecer la agregación de proteínas. Centrifugar para pelletar proteínas y restos celulares.

Transfiere el sobrenadante a un tubo que contenga isopropanol y mezcle para precipitar el ADN en cadenas visibles. Centrifugadora para pelletar el ADN.

Lava el pellet con etanol para eliminar impurezas, seca al aire y rehidrata el ADN.

Incubar a alta temperatura para solubilizar el ADN y luego cargar una muestra en una microcubeta.

Utilizando un espectrofotómetro, mide la concentración de ADN aislado.

Primero, usa tijeras limpias para cortar una hoja entera fresca de un árbol cítrico y colócala en una bolsa de plástico limpia para bocadillo. Luego, enfría un mortero añadiendo una pequeña cantidad de nitrógeno líquido. Después, utiliza las tijeras para cortar pequeños trozos del tejido foliar, de aproximadamente una pulgada cuadrada.

Coloca los trozos de hoja en el mortero para congelarlos inmediatamente. Empieza rápidamente a moler el tejido foliar con el mortero hasta que el nitrógeno líquido se evapore y quede un polvo verde fino. Después, enfría una espátula metálica en nitrógeno líquido durante 10 a 15 segundos. Luego usa la espátula fría para extraer el tejido molido del mortero en un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Utiliza una pipeta de 1000 microlitros para añadir 600 microlitros de solución de lisis de núcleos a la muestra. Luego, haz un vórtice de la muestra durante uno a tres segundos. Incuba el tubo a 65 grados Celsius, en baño maria durante 15 minutos.

Una vez finalizado el periodo de incubación, utiliza una pipeta de 10 microlitros para añadir 3 microlitros de solución de RNasa al lisato y eliminar ARN. Luego, mezcla el contenido del tubo invirtiéndolo de dos a cinco veces.

Incuba a 37 grados Celsius durante 15 minutos en una incubadora en armario. Después de 15 minutos, añade 200 microlitros de solución de precipitación de proteínas a la muestra. Gira el tubo a alta velocidad durante 20 segundos. A continuación, centrifuga la muestra a 13000 g durante tres minutos.

Durante la centrifugación, añadir 600 microlitros de isopropanol mantenido a temperatura ambiente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Tras finalizar la centrifugación, retira cuidadosamente el sobrenadante del tubo de la centrifugadora hacia el tubo que contiene isopropanol. Descarta la bola.

Invierte el tubo para que el ADN sea visible, como una hebra hiláver. A continuación, centrifuga la muestra a 13000 g durante un minuto a temperatura ambiente.

Decanta el sobrenadante tras la centrifugación. Luego, añade 600 microlitros de etanol al 70% al pellet. Invierte el tubo varias veces para lavar el pellet.

Centrifuga el tubo a 13000 g durante un minuto. Tras finalizar la centrifugación, aspira cuidadosamente el sobrenadante. Luego invierte el tubo con la tapa abierta sobre un papel absorbente para que seque al aire durante 15 minutos.

Una vez seca, añade 100 microlitros de solución de rehidratación de ADN al pellet. Incuba la suspensión de ADN a 65 grados Celsius en un baño maria durante una hora. Golpea el tubo periódicamente mientras mezclas.

Añade 1 microlitro de agua purificada en una micro-cubeta. Lee el agua en blanco en el espectrofotómetro. Luego, añade 1 microlitro de la muestra en la microcubeta. Coloca la microcuveta en el espectrofotómetro y obtienes la concentración de ADN.