Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:22 min. • January 30th, 2026
Tomemos glóbulos rojos de oveja (SRBCs) con IgM-opsonizados con anticuerpos IgM unidos a los antígenos de la superficie celular.
Añade suero que contenga proteínas del complemento excepto C5.
El complejo C1 se une a los anticuerpos y se activa en el conjunto.
El C1 activado parte C4 y C2, formando C3 convertasa, que luego parte C3 y deposita C3b en los SRBCs.
Sin C5, C3b se degrada a C3bi.
Añade los SRBCs a un cultivo de macrófagos.
C3bi se une al receptor de macrófagos, desencadenando la fagocitosis de SRBC.
Añade una solución hipotónica para lisar y elimina los SRBC no internalizados.
Añade un tampón de lisis para lisar las células y libera hemoglobina SRBC.
Introduce un reactivo de detección.
En presencia de urea, la hemoglobina cataliza la oxidación del diaminofluoreno por peróxido de hidrógeno, produciendo un producto coloreado.
Mide la absorbancia del producto coloreado, que es proporcional a las SRBC fagocitadas.
Este ensayo modela la fagocitosis de bacterias marcadas con anticuerpos utilizando SRBCs opsonizados para imitar objetivos bacterianos.
Para un ensayo de opsonización, incubar 2 veces 10 hasta el octavo glóbulos rojos de oveja o SRBCs con 50 microlitros de inmunoglobulina anti-SRBC de conejo M o IgM durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Luego incubar los SRBCs opsonizados con 50 microlitros de suero humano deficiente en C5 durante 30 minutos a 37 grados Celsius para fijar los fragmentos del complemento de C3b e inhibidor de C3b en los SRBCs recubiertos de IgM.
A continuación, aspira el medio y añade 100 microlitros de 1 por 10 a los siete SRBCs opsonizados por mililitro de medio a cada pozo de una placa de 96 pozos que contiene 1 por 10 a la cuarta parte de macrófagos murinos cultivados durante la noche por pozo.
Incubar la cocultura de macrófagos de ratón con SRBC durante 1 hora a 37 grados Celsius y luego retirar los SRBC no unidos lavando con 100 microlitros de tampón de lisis cloruro de amonio y potasio durante 1 minuto.
Una vez retirados los SRBC no unidos, enjuaga con 100 microlitros de medio. Lisar las células restantes con dodecilo sulfato de sodio al 0,1% y tratar los lisados con 50 microlitros de 2,7-diaminofluoreno suplementados con peróxido de hidrógeno al 3% y urea molar de 6 moles.
Luego mide la absorbancia de la formación azul de flúeno catalizada por hemoglobina en un espectrofotómetro a 620 nanómetros.
Utiliza una curva estándar a valores de absorbancia de 620 nanómetros con el número conocido de SRBCs para determinar el número de SRBCs opsonizados que están fagocitados.