Hiperinsulinémico euglucémico pinza en la rata consciente

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la sensibilidad a la insulina en la rata consciente y sin restricción. Esto se logra primero cateterizando la arteria carótida izquierda. A continuación, se cateteriza la vena yugular derecha para asegurar resultados óptimos.

Los catéteres se lavan diariamente para mantener la permeabilidad durante un período de recuperación postoperatoria de cinco días. Finalmente, se pueden obtener resultados del clamp euglucémico hiperglucémico que muestran las tasas de infusión de glucosa en todo el cuerpo. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener mediciones directas de las tasas de eliminación de glucosa en todo el cuerpo a niveles fisiológicos altos de insulina.

Los catéteres arteriales y venosos deben prepararse con anticipación al procedimiento quirúrgico. El catéter debe tener extremos romos, estar lleno con solución salina heparinizada y ser esterilizado con etanol, con un retenedor fijado firmemente a 2,7 o 3,2 centímetros de un extremo para los catéteres arterial y venoso, respectivamente. En este procedimiento se utilizan ratas macho adultas de la variedad spray dolly con un peso aproximado de 300 gramos.

Registre el peso inicial del animal y utilice este peso para monitorear la ganancia de peso posterior a la cirugía. Trabaje en un área quirúrgica aséptica. Anestesie la rata con isoflurano al 3 % colocándola en una caja anestésica.

Traslade el animal fuera del área quirúrgica y prepare el sitio de la incisión eliminando el vello alrededor del cuello y los hombros. Una vez eliminado el vello, coloque al animal en un cono nasal para mantener la anestesia con aproximadamente 2 % de isoflurano. Sujete firmemente al animal a la mesa quirúrgica.

Asegúrese de que la rata esté completamente anestesiada verificando la presencia de reflejos en la pata y/o en el ojo. Limpie el sitio de la incisión con etanol al 70 %, seguido de una limpieza con Betadine y nuevamente con etanol al 70 %. El primer paso del procedimiento consiste en realizar una pequeña incisión media vertical de 10 milímetros por encima del esternón.

Utilice fórceps curvos de disección microquirúrgica para separar por disección romo el tejido y exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo. Refleje este músculo para revelar aproximadamente un centímetro de la arteria carótida izquierda. Coloque los fórceps de disección microquirúrgica debajo de la arteria carótida para mantenerla en su lugar mientras separa suavemente el tejido conectivo.

Es importante aislar el nervio vago de la arteria sin dañar ni la arteria ni el nervio. Utilice sutura de seda estéril 4-0 para ligar el extremo cefálico. Sujete el vaso con pinzas microquirúrgicas para disección dentadas.

Puncione el ligado. Termine con un adaptador de muestra múltiple ven eject de calibre 21. Retire el tapón de acero inoxidable del catéter y utilice un introductor estéril de catéter para guiarlo hacia la arteria.

Utilice pinzas para asegurar el catéter. Parcialmente, suelte las pinzas de disección microquirúrgica, ocluyendo la arteria, y continúe insertando el catéter hasta el nivel del gránulo. En este momento, la punta del catéter debe encontrarse en el arco aórtico.

Sujete dos suturas debajo del disco y una encima, y lave la línea con solución salina heparinizada de 10 unidades por mililitro. Para confirmar que el catéter estará listo para muestrear, vuelva a tapar el extremo externo del catéter con un tapón de acero inoxidable. A continuación, realice una disección roma del tejido para exponer la vena yugular externa derecha, aísle cuidadosamente la vena y ligue la cefálica.

Finalice con sutura de seda. Puncione la vena con una aguja de calibre 21. Extraiga el adaptador de cebo para muestras múltiples.

Retire el tapón de acero inoxidable del catéter y utilice un introductor estéril de catéter para insertarlo hasta la bolita. Asegure dos suturas debajo de la bolita y una encima. Luego, lave la línea con solución salina con heparina al hielo de 10 unidades por mililitro.

Para confirmar que el catéter tomará la muestra, vuelva a tapar el extremo externo del catéter con un tapón de acero inoxidable utilizando una aguja roma de calibre 14, pase por debajo de la piel y realice una incisión en la espalda entre los omóplatos. A continuación, pase los catéteres a través de la aguja de modo que salgan por la parte posterior de la rata. Debe haber aproximadamente cuatro centímetros de cada catéter visibles.

Corte 0,5 centímetros de tubo médico Tigon S 50 HL y colóquelo alrededor de ambos catéteres exteriorizados. Sujete con cinta azul para venas y roja para arterias. Vuelva a probar los catéteres para asegurar su permeabilidad y luego enjuáguelos y llénelos con solución salina heparinizada a 150 unidades por mililitro para prevenir la formación de coágulos.

Cierre todas las incisiones con sutura de seda 3-0. Coloque la rata en posición prona en una jaula limpia precalentada con alimento fácilmente accesible. Una vez que la rata recupere completamente su capacidad de movimiento y estado de alerta, devuélvala a la jaula de origen.

Permita que la rata se recupere durante tres a cinco días, monitoreando diariamente signos de infección, dolor y cambios en el peso. Es importante mantener la permeabilidad del catéter durante todo el estudio. Cada día posterior a la cirugía, llene jeringas de punta deslizante de un mililitro con solución salina heparinizada a 150 unidades por mililitro y coloqueles una aguja roma de calibre 22.

La aguja roma se inserta en 20 centímetros de tubo PE 50 con un acoplador de tubo de acero inoxidable de calibre 23 en el otro extremo. Asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire de la línea. Pinzar la línea arterial exteriorizada de la rata con pinzas hemostáticas. Justo debajo del tapón.

Retire el tapón del catéter de acero utilizando otro par de hemostatos. Introduzca el acoplador de tubo conectado a la jeringa en la línea arterial y libere los hemostatos que obstruyen el catéter arterial exteriorizado. A continuación, aspire la sangre arterial del catéter hacia la jeringa.

Si el catéter no aspira fácilmente, puede ser necesario empujar muy suavemente una pequeña cantidad de solución a través del catéter para desalojar la punta. Se considera que el catéter está despejado. Cuando la sangre alcance la jeringa, cierre la pinza del tubo P 50 cerca de la jeringa de un mililitro y deseche la jeringa.

Sustituya con una nueva jeringa llena de solución salina con heparina fría. Abra la pinza del tubo y, mientras sostiene la nueva jeringa en posición vertical, golpee suavemente la jeringa para desalojar las burbujas de aire hacia arriba y alejarlas de la línea. Inyecte la solución salina heparinizada hasta que la línea del catéter esté limpia y libre de sangre.

Cierre con pinza la línea arterial justo debajo del acoplador del tubo. Retire el conector de la jeringa de la línea del catéter arterial y sustitúyalo por el tapón de tubo de acero inoxidable. Suelte los hemostatos que obstruyen el catéter arterial externo.

Repita este procedimiento para la línea venosa. Debido a la baja presión venosa, es posible que no se pueda realizar el muestreo. En general, si la solución salina heparinizada puede infundirse con resistencia mínima, es probable que el catéter esté bien posicionado en la vena.

Antes de comenzar el procedimiento, se deben pesar los animales, preparar las soluciones y armar el aparato de sujeción. Después de pesar al animal y confirmar la permeabilidad del catéter, colóquelo en un recipiente pequeño con cama que limite pero no restrinja el movimiento. Las ratas utilizadas en este estudio permanecen en ayunas durante al menos cinco horas y cumplen con los requisitos de ganancia de peso posoperatorio. El peso de la rata determina la cantidad de insulina necesaria aquí.

Se administra cuatro mil unidades por kilogramo por minuto a una velocidad de dos microlitros por minuto. Prepare una solución de dextrosa al 50 % y asegúrese de que haya suficiente cantidad de ambas soluciones para que duren aproximadamente dos horas; aquí se utilizan jeringas de tres mililitros. Ahora está listo para armar el aparato de sujeción.

Configure las líneas y las bombas de infusión como se muestra aquí. Coloque las jeringas de glucosa e insulina en la bomba de jeringas. Cierre las líneas con pinzas y permita que la rata se relaje durante 30 minutos antes de comenzar el experimento.

Para comenzar el procedimiento, tome una muestra basal de insulina y una muestra de hematocrito; el muestreo de hematocrito asegura que el volumen sanguíneo se mantenga durante todo el experimento. Por lo general, los niveles de hematocrito no deben disminuir más del 10 % del valor inicial. Obtenga una muestra basal de glucosa y determine el nivel de glucosa que se mantendrá constante.

Aquí se realiza el clamp a una glucemia de U o cinco milimolar. Después de cada muestra de sangre, lavar la línea arterial con un pequeño volumen de solución salina heparinizada al 10 unidades por mililitro para prevenir la coagulación. Tras determinar el nivel de glucosa a mantener constante, iniciar la infusión de la solución de insulina.

Registre la glucemia a intervalos de cinco a diez minutos y ajuste la velocidad de infusión de glucosa según sea necesario hasta alcanzar un estado estable. Este proceso generalmente es de ensayo y error y puede tardar desde 30 minutos hasta más de dos horas. El nivel de glucosa requerido para mantener la glicemia depende del protocolo experimental.

Las especies y condiciones presentes para considerar que se ha alcanzado un estado estabilizado requieren que tres mediciones consecutivas caigan dentro de un rango definido. Tres mediciones dentro de aproximadamente un milimolar entre sí indican que los niveles de glucosa han alcanzado un estado estable. La velocidad de infusión de glucosa necesaria para mantener la glicemia durante un período de 30 minutos puede complementarse con muestras sanguíneas adicionales obtenidas en este intervalo como mínimo.

Se debe recoger una segunda muestra de hematocrito de insulina plasmática una vez finalizado el procedimiento del clamp. Los animales pueden utilizarse para pruebas adicionales o ser sacrificados para la recolección de tejidos destinados a análisis posteriores. Dependiendo del animal, las líneas cateterizadas pueden mantenerse permeables durante cinco a siete días si se realizan correctamente.

El procedimiento de bloqueo puede medir la sensibilidad al insulina en estado estacionario. Es esencial registrar los niveles de insulina y glucosa, así como las tasas de infusión de glucosa y los valores de hematocrito. Se alcanza el estado estacionario cuando los niveles de glucosa permanecen dentro de un milimolar entre sí durante un período de 30 minutos.

La tasa de infusión de glucosa revela el nivel de glucosa exógena requerido para mantener la glucemia en ayunas, donde la tasa posible debe graficarse a lo largo del tiempo en lugar de un único punto temporal promedio. Deben informarse tanto los niveles de insulina en ayunas como los niveles de insulina durante el clamp. Estas mediciones confirman que la insulina se administró correctamente y permitirán detectar cualquier diferencia en la respuesta de insulina entre los grupos de tratamiento. La medición de los niveles de hematocrito en la línea base y nuevamente después del procedimiento asegura que los niveles no hayan disminuido más del 5 % respecto a la línea base durante el transcurso del experimento. Tras seguir este procedimiento.

Otros métodos, como la administración de trazadores isotópicos, pueden utilizarse para evaluar la utilización de glucosa a nivel corporal y específico de tejidos.