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Comienza añadiendo una solución que contiene sondas bacterianas de hibridación in situ (FISH) específicas de ARNr 16S a una lámina que contiene las secciones intestinales del ratón colonizadas por bacterias.
Colocar un abrigo para dispersar las sondas que contienen el líquido y evitar la evaporación.
Incubar el portaobjetos en una cámara humidificada a una temperatura elevada.
Esto despliega la estructura secundaria del ARN, facilitando la hibridación de la sonda con secuencias complementarias en el ARNr bacteriano 16S.
Retira el abrigo y incuba la lámina en un amortiguador de lavado precalentado para eliminar las sondas sueltas.
Enjuaga con un tampón de fosfato para mantener el pH fisiológico.
Aplica un contratinte que contenga un tinte específico para mucosidad y un colorante nuclear, y incuba.
Estos tintes se unen selectivamente al moco intestinal y al ADN de las células bacterianas y hospedadoras. Lava la corredera con un buffer y monta las cubiertas sobre la corredera usando medios de montaje.
Bajo un microscopio confocal, observa bacterias marcadas como FISH, células intestinales y la capa mucosa en las secciones.
Crea círculos muy cerrados alrededor de cada sección de tejido utilizando un bloqueador líquido o un bolígrafo PAP para limitar el área de expansión que debe cubrir la solución de hibridación, evitando el contacto de tinta con la sección.
Prepara la solución de hibridación y añade 0,5 microgramos de sonda por cada 50 microlitros de la solución utilizada. Pipetea la solución sobre las secciones del portaobjetos. Cubre la sección con cubiertas de plástico flexibles, asegurando que el volumen de líquido utilizado cubra toda la sección.
Crea una cámara húmeda con una caja de punta de pipeta con toallitas o papel de cocina empapados con exceso de solución de hibridación o PBS para proporcionar humedad. Incuba el portaobjetos en la cámara húmeda a 45 a 50 grados Celsius durante al menos tres horas, dependiendo de la sonda configurada para reducir la evaporación. Quita las cubiertas de plástico e incuba las láminas en un tampón de lavado FISH en un tarro de Coplin, ambos precalentados a 50 grados Celsius.
Vuelve a colocar el tarro Coplin en el horno a 50 grados Celsius durante 10 a 20 minutos. Quita el buffer de lavado de FISH y reemplácelo por PBS en el tarro de Coplin. Inmediatamente después de rellenar el tarro de Coplin con PBS, decanta el PBS.
Retira las láminas del tarro y pipetea la contratinción encima de toda la sección, asegurándote de no tocar el pañuelo con la punta de la pipeta. Incuba a 4 grados Celsius durante 45 minutos. Lava las manchas tres veces rápidamente con PBS nuevo.
Limpia la parte trasera de las láminas contra una toallita o papel de cocina y deja que la mayor parte del PBS se evapore de las secciones con ayuda de una línea de vacío conectada a una punta de pipeta. Monta las secciones usando un medio de montaje. Fija las fundas a la corredera pintando los bordes de la capa con esmalte transparente, cuidando de no acercarte al borde de la corredera. Déjalo fijar a temperatura ambiente.