JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:04 min • January 30th, 2026
Comienza con un cultivo de Legionella pneumophila, una bacteria patogénica Gram negativa que libera vesículas de membrana externa.
Estos OMVs contienen lipopolisacáridos y proteínas de membrana que contribuyen a la virulencia bacteriana.
Centrifuga el cultivo para pelletar bacterias intactas.
Recoge los OMVs que contienen el sobrenadante y centrifuga de nuevo para pelletar bacterias residuales.
Filtra el sobrenadante a través de una membrana para eliminar las bacterias restantes mientras retienes los OMVs.
Realiza una segunda filtración utilizando una membrana fresca para eliminar los restos bacterianos.
Recoge el filtrado libre de bacterias y ultracentrífuga para pelletar los OMVs.
Descarta el sobrenadante, vuelve a suspender el pellet en el tampón y vuelve a ultracentrífuga para eliminar proteínas y lipopolisacáridos ligeramente asociados.
Quita el sobrenadante y vuelve a suspender los OMVs purificados en buffer.
Estria una alícuota de los OMVs sobre las placas de agar sanguíneo y BCYE e incuba.
La ausencia de formación de colonias confirma la ausencia de contaminación bacteriana.
Almacena los OMVs a baja temperatura para los estudios de interacción huésped-patógeno.
Añade el cultivo líquido restante a 90 mililitros de medio YEB fresco e incuba el cultivo en un agitador giratorio hasta que alcance un ODde 600 de 3,0 a 3,5. Centrifuga el cultivo líquido a 4.000 g durante 20 minutos para pelletar las bacterias. Luego transfiero el sobrenadante a tubos de centrífuga nuevos.
Descarta los perdigones bacterianos y centrifuga las muestras de nuevo antes de repetir el paso de centrifugación una vez más. Después, esteriliza el sobrenadante restante dos veces.
Luego transfiere el sobrenadante libre de bacterias a tubos de ultracentrífuga y centrifuga las muestras a 100.000 g a 4 grados Celsius durante 3 horas. Descarta el sobrenadante. Luego usa PBS estéril para volver a suspender los bolítos OMV y agruparlos.
Repite el paso de ultracentrifugación para eliminar proteínas contaminantes y LPS libre. Ahora, descarta el sobrenadante y seca el tubo ultracentrífuga con un hisopo de algodón estéril. Resuspende el perdigón OMV con 500 microlitros de PBS estéril.
Luego, estría 20 microlitros cada una sobre las placas de agar sanguíneo y BCYE para excluir la contaminación bacteriana de la vesícula preparada. Incuba la placa de agar en sangre durante la noche y la placa de agar BCYE durante 3 días.