Aislamiento de células epiteliales de la vejiga del ratón que contienen comunidades bacterianas intracelulares
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 2:56 min • February 2nd, 2026
Comienza con células epiteliales de la vejiga raspadas de una vejiga de ratón infectada con E. coli uropatógeno marcado con fluorescente.
Durante la infección, estas bacterias invaden las células epiteliales y forman comunidades bacterianas intracelulares, o IBCs, estructuras similares a biopelículas que las protegen de las defensas inmunitarias del huésped.
Bajo un microscopio disecador, identificar los IBC como grandes agregados fluorescentes confinados dentro de células epiteliales individuales.
Montar un sistema de micropipeteo bucal utilizando un capilar de vidrio estirado conectado a una pipeta aspiradora para aislar células epiteliales individuales que contienen IBC.
Sumerge brevemente la punta capilar en PBS para reducir la absorción de líquidos impulsada por los capilares.
Coloca el capilar cerca de la célula epitelial fluorescente seleccionada y aplica una succión suave para atraer una sola célula que contenga IBC, evitando células no infectadas y bacterias extracelulares.
Expulsa la célula en un tubo microcentrífuga estéril usando una ligera presión positiva, preservando la viabilidad bacteriana.
Este método permite aislar células epiteliales que albergan IBCs para el análisis de células individuales.
Cuando todas las celdas hayan sido raspadas, inserta el extremo sin estirar de un capilar de vidrio tirado en el tapón de goma de un tubo aspirador y ajusta firmemente el extremo estrecho de la punta de una pipeta de 1 mililitro en el otro extremo abierto del tubo.
Ajusta firmemente el extremo estrecho de una pipeta aspiradora de 2 mililitros en el extremo abierto y ancho de la punta de la pipeta de 1 mililitro y coloca la suspensión de celda raspada bajo un microscopio disecante. Utilizando una ampliación de 20 a 40X, identifica los IBC como grandes agregados fluorescentes y sumerge el extremo fino del capilar de vidrio en un tubo fresco de PBS durante 1 segundo para reducir la absorción de volumen no deseado mediante acción capilar.
Cuando se haya localizado un IBC de interés, acerca lentamente el extremo abierto del tubo capilar hacia el IBC y aplica una fuerza de succión muy pequeña a la pipeta aspiradora para guiar el IBC hacia el capilar de vidrio. Luego, mueve el capilar a un tubo de centrífuga vacío de 1,5 mililitros y aplica una ligera presión positiva para expulsar la gota y el IBC dentro del tubo.
Descripción general
Este artículo describe un método para aislar comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) de células epiteliales de la vejiga infectadas con E. coli uropatógena. La técnica permite el análisis de células individuales que contienen IBCs, proporcionando información sobre el comportamiento bacteriano dentro de las células huésped.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología celular
- Enfermedades infecciosas
Antecedentes
- La E. coli uropatógena puede invadir las células epiteliales de la vejiga.
- Las CBI son estructuras similares a biopelículas que protegen a las bacterias de las respuestas inmunitarias.
- Comprender las CBI puede ayudar en el desarrollo de tratamientos para las infecciones del tracto urinario.
- El análisis de células individuales es fundamental para estudiar las interacciones bacterianas dentro de las células hospedadoras.
Objetivo del estudio
- Aislar células epiteliales que contienen IBC para un análisis detallado.
- Comprender la dinámica de las comunidades bacterianas dentro de las células hospedadoras.
- Ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de supervivencia bacteriana en el tracto urinario.
Métodos Utilizados
- Roer células epiteliales de la vejiga de ratones infectados.
- Utilizar un microscopio estereoscópico para identificar IBC fluorescentes.
- Emplear un sistema de micropipeteo para aislar células individuales que contengan IBC.
- Mantener la viabilidad bacteriana durante el proceso de aislamiento.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de células epiteliales que contienen IBC.
- Identificación de los IBC como agregados fluorescentes grandes.
- Demuestra la eficacia del método para el análisis de células individuales.
- Información sobre los mecanismos de protección de los IBC frente a las defensas del huésped.
Conclusiones
- El método proporciona un enfoque confiable para estudiar los IBC en células epiteliales de la vejiga.
- Las células aisladas pueden utilizarse para investigaciones adicionales sobre la patogénesis bacteriana.
- Esta investigación contribuye a comprender las infecciones del tracto urinario.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar comunidades bacterianas intracelulares (IBCs) de células epiteliales hospedadoras permite descartar mecanismos de riesgo en objetivos antimicrobianos en modelos de infección del tracto urinario. Este enfoque apoya la validación de objetivos al revelar mecanismos de supervivencia bacteriana dentro de entornos celulares hospedadores fisiológicamente relevantes. El método proporciona confianza predictiva para la identificación de compuestos líderes al vincular la persistencia intracelular con la eficacia terapéutica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento de células epiteliales viables que contienen IBC para la evaluación funcional de dianas.
- Valor operativo: Permite la desestimación biológica mediante la observación directa de poblaciones bacterianas protegidas por antibióticos.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al vincular mecanismos de persistencia intracelular con los resultados del tratamiento.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas huésped-patógeno validados para la selección de compuestos posteriores frente a reservorios intracelulares.
- Resultado cuantitativo: Genera aislamientos a nivel de célula individual que permiten lecturas basadas en fluorescencia o secuenciación para análisis de alto contenido.
- Reproducibilidad: Estandariza el aislamiento mediante micropipeteo bucal para garantizar una recuperación consistente de células que contienen IBC en diferentes experimentos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza un modelo de infección urinaria murino para mantener la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Se centra en las vías de supervivencia intracelular para reducir la ambigüedad en la selección de dianas.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar/no continuar mediante la validación de dianas dentro de nichos bacterianos protegidos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, permitiendo la comprobación de hipótesis antes de la identificación de compuestos activos y apoyando la continuidad preclínica mediante una comprensión mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías al aislar células que albergan IBC con características de biopelícula para la interrogación de dianas.
- Detección: Proporciona células individuales listas para ensayos, para evaluar la penetración de compuestos en compartimentos intracelulares.
- Análisis: Ofrece aislamientos viables para la cuantificación de fluorescencia o secuenciación de ARN (RNA-seq) con el fin de comparar los efectos del tratamiento.
- Investigación Traducional: Conecta los mecanismos de persistencia intracelular con modelos preclínicos de eficacia en infecciones del tracto urinario (UTI).
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de aislamiento reutilizable para el estudio de patógenos intracelulares en diversos modelos de infección.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al vincular la localización intracelular con la resistencia fenotípica.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y reproducibilidad mediante parámetros definidos de micropipeteo.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al reducir los riesgos de los objetivos al inicio de la fase de descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de antibióticos con actividad intracelular.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microscopía y micropipeteo para el aislamiento de células individuales.
- Depende de la marcación fluorescente y de la infraestructura de microscopio estereoscópico para la detección de IBC.
- Necesita estandarización entre operadores para mantener la consistencia en la recuperación celular y la viabilidad.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a diferentes tipos de células epiteliales o modelos de patógenos.
- Limitado por el rendimiento manual, lo cual puede restringir la escalabilidad en campañas de cribado extensas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón
Videos relacionados
0 Vistas
Infección del tracto urinario en un modelo Animal pequeño: cateterización transuretral de ratones machos y hembras
Videos relacionados
0 Vistas
Seguimiento longitudinal de las infecciones del tracto urinario y su tratamiento en ratones utilizando imágenes de bioluminiscencia
Videos relacionados
0 Vistas
Preparación del tejido de vejiga de ratón para la visualización de infecciones bacterianas
Videos relacionados
0 Vistas
Visualización de comunidades bacterianas intracelulares en una vejiga de ratón infectada
Videos relacionados
0 Vistas
Cateterismo transuretral e inoculación bacteriana para generar un modelo de infección del tracto urinario en ratones machos
Videos relacionados
0 Vistas
Establecimiento de un modelo de infección del tracto urinario en ratones hembra
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de las células gliales entéricas de la Submucosa y la lámina propia del ratón adulto
Videos relacionados
0 Vistas
Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular
Videos relacionados
0 Vistas
Detección de bacterias residentes en el tejido en biopsias de vejiga por 16S rRNA Fluorescence In Situ Hybridization
Videos relacionados
0 Vistas
Última actualización: 29 agosto 2026