Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 4:02 min. • February 2nd, 2026
Tomemos ARN total extraído de un cerebro de ratón infectado con bacterias patógenas. El extracto contiene transcripciones de genes sensibles a la infección.
Añadir una enzima que degrada el ADN e incubar para degradar el ADN genómico residual.
Añade una mezcla maestra que contenga la enzima transcriptasa inversa (RT), nucleótidos y cebadores inespecíficos.
Incubar para sintetizar ADN complementario (ADNc).
Introduce una temperatura alta para inactivar la enzima RT.
Toma una mezcla maestra que contiene ADN polimerasa, nucleótidos, un colorante de doble cadena que se une al ADN y cebadores específicos para un gen objetivo.
Añade el ADN c y aplica calor para desnaturalizar el ADN.
El cebador se une al ADN c-objetivo, permitiendo la síntesis de nuevas cadenas de ADN.
El ciclo se repite para amplificar el gen objetivo.
El tinte se une al ADN amplificado y emite fluorescencia, que se registra al final de cada ciclo.
El aumento de la fluorescencia confirma la expresión del gen sensible a la infección en el cerebro del ratón infectado.
Infectar a todos los ratones utilizando células planctónicas o células del estado de biofilm y realizar la eutanasia según lo descrito en el protocolo de texto. A continuación, extrae el ARN total del tejido cerebral usando un kit de extracción de ARN.
Para cada ratón, utiliza tejido cerebral completo para extraer ARN. Divide todo el tejido cerebral en cinco tubos. Toma hasta 100 miligramos de tejido cerebral y añade 1 mililitro de solución de lisis a cada tubo que contiene la matriz de lisis proporcionada por el kit.
Extrae el ARN siguiendo los pasos indicados en el protocolo de texto. A continuación, realiza la síntesis de ADNc, incluyendo la eliminación del ADN genómico, utilizando un termociclador con un kit de reactivos de transcripción inversa. Añadir 1 microgramo de ARN a un tubo que contiene 2 microlitros de 5x tampón de eliminación de ADN genómico y 1 microlitro de enzima de eliminación de ADN genómico.
Añade agua sin RNasa hasta que el volumen alcance los 10 microlitros. Incuba durante 2 minutos a 42 grados Celsius. Añade 10 microlitros de mezcla maestra a la solución de reacción y luego mezcla suavemente.
Procede inmediatamente a la reacción de transcripción inversa colocando el tubo a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego transfiero la reacción a 85 grados Celsius durante 5 segundos. Realiza el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real con un kit de PCR cibercuantitativa en tiempo real. Siguiendo las instrucciones del kit, combina la enzima, los cebadores, el colorante de referencia ROX 50x dos y la plantilla de ADNc. Luego se añade agua sin RNasa hasta alcanzar un volumen total de 20 microlitros.
Ejecuta cada muestra en triplicado usando los parámetros térmicos listados en el protocolo de texto y calcula el cambio relativo de plegamiento basándose en el método CT de dos menos delta delta.