Infección oral de Drosophila melanogaster con bacterias patógenas

Toma un frasco con tapa que contenga agar nutritivo superpuesto con papel filtro.

Aplica una suspensión de bacterias patógenas sobre el papel de filtro.

Introduce una mosca de Drosophila melanogaster hambrienta en el frasco y luego coloca la tapa. Incubar para permitir la alimentación y asegurar la ingestión bacteriana.

Las bacterias ingeridas entran en el intestino y penetran la membrana protectora que recubre la luz.

Las bacterias se adhieren al epitelio subyacente, liberan toxinas que promueven daños e invasión epiteliales, y colonizan los tejidos internos.

Sumerge la mosca en alcohol para eliminar las bacterias asociadas a la superficie, luego enjuaga para eliminar el alcohol.

Añade un tampón y homogeneiza la mosca para liberar el contenido bacteriano interno.

Realizar diluciones en serie del homogenado en una microplaca. A continuación, placar las diluciones sobre agar nutritivo e incubar para permitir la formación de la colonia.

Cuenta las colonias para determinar el número de células bacterianas viables resultantes de la infección oral en la mosca.

Dos a cuatro horas antes de la infección oral, transfiere las moscas a viales estándar de agar que no contengan comida. Mientras tanto, para cada mosca, prepara un vial para infección.

Primero, carga la tapa de un tubo de muestra de 7 mililitros con 500 microlitros de agar de azúcar estándar y deja que se solidifique. Después, mete un disco de papel filtro en el agar. Luego pipeteo 100 microlitros de cultivo bacteriano directamente sobre el disco filtrante. Para los controles, usa agua con sacarosa al 5%.

Tras el periodo de inanición, transfiere moscas individuales a los tubos preparados. Tras incubar las moscas durante 18 a 24 horas, esteriliza las moscas en superficie. Carga a los individuos en un tubo que contenga 100 microlitros de etanol al 70%.

Tras 20 a 30 segundos, retira el etanol y retitúelo por 100 microlitros de agua triple destilada. Después de otros 20 a 30 segundos, retira el agua. Luego añade 100 microlitros de PBS y homogeneiza la mosca.

Transfiere el homogeneado a la fila superior de una placa de 96 pozos y añade 90 microlitros de 1x PBS a cada pozo por debajo. Luego, usando alicuotas de 10 microlitros, diluye en serie esta muestra para distinguir un rango de valores de UFC. A continuación, emplata las diluciones en serie en una placa de agar nutritivo de LB en gotas de 5 microlitros.

Coloca las gotas de forma que queden discretamente en la placa. Luego incuba el plato durante la noche. Al día siguiente, calcula el número de UFC a partir de la dilución que produce entre 10 y 60 colonias claramente visibles.