Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 2:12 min. • January 30th, 2026
Tomemos una mezcla que contenga volúmenes iguales de dos suspensiones de Agrobacterium tumefaciens , cada una portando un plásmido: uno codifica GFP y el otro codifica una proteína efectora.
Perfora un agujero y utiliza una jeringuilla sin aguja para infiltrar la mezcla en la superficie inferior de hojas sanas y completamente expandidas de Nicotiana benthamiana 16c.
Seca cualquier exceso de suspensión con tejido blando para evitar el crecimiento bacteriano excesivo.
Marca las zonas infiltradas e incuba las plantas en condiciones óptimas de crecimiento.
Agrobacterium transfiere el ADN plasmídico a las células vegetales, donde los genes GFP y efectores se transcriben en ARNm y se traducen en proteínas.
El sistema de defensa de la planta utiliza silenciamiento de ARN, donde los siRNA dúplex se cargan en RISC. Se retira la hebra pasajera, y la hebra guía dirige al complejo para degradar el ARNm de GFP objetivo.
Sin embargo, las proteínas efectoras se unen a los siARN, impidiendo su asociación con RISC y permitiendo que la fluorescencia de GFP persista.
Esto permite identificar efectores patógenos que suprimen el silenciamiento del ARN vegetal.
Mezcla volúmenes iguales de un cultivo de Agrobacterium que contenga la proteína fluorescente verde 35S con un cultivo de Agrobacterium que contenga el supresor del virus mosaico de pepino 35S 2b, efector putativo o vector vacío. Utilizando una jeringuilla sin aguja de 1 mililitro, infiltra con cuidado y despacio las suspensiones mixtas de Agrobacterium en los lados abaxiales de las hojas de Nicotiana bethamiana 16c.
Retira la suspensión bacteriana restante de las hojas con toallitas de tejido blando y recorre los márgenes de las manchas infiltradas con un rotulador.