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Comienza disociando mecánicamente los bazos neonatales de ratón para generar una suspensión unicelular.
Transfiere la suspensión a un tubo, centrifuga y retira el sobrenadante.
Suspende el pellet en un tampón de lisis para eliminar los eritrocitos.
Añade el buffer, centrifuga de nuevo y quita el sobrenadante.
Suspender las células en buffer e incubarlas con microperlas magnéticas recubiertas de anticuerpos que apunten a un receptor expresado en neutrófilos y monocitos inflamatorios.
Centrifuga y retira las perlas sueltas. Añade buffer, luego pasa la suspensión a través de una columna ferromagnética y aplica un campo magnético para conservar las celdas unidas a la perla.
Elimina el campo magnético, eluye las células con un tampón y siembralas en una placa de varios pozos.
Añade concentraciones crecientes de bacterias luminiscentes a pozos seleccionados.
Incubar para permitir que neutrófilos y monocitos interioricen las bacterias mediante fagocitosis.
Sustituye el medio por medio que contenga antibióticos para eliminar bacterias no internalizadas.
Registrar la luminiscencia a intervalos regulares para evaluar la internalización bacteriana y la posterior muerte inducida por la fagocitosis.
Para realizar un ensayo in vitro de eliminación bacteriana, colocar el bazo no infectado en un colador de nylon de 40 micrómetros dentro de una placa de Petri estéril de 60 milímetros que contenga 5 mililitros de PBS suplementado con suero bovino fetal al 10%, y utilice un émbolo de jeringuilla estéril de 3 mililitros para desagregar el tejido en una suspensión celular única. Transfiere las pilas a un tubo centrífuga de 15 mililitros y recógelas mediante centrifugación. Resuspende el pellet en 1 mililitro de tampón de lisis de glóbulos rojos por 3 a 4 bazos.
Después de 5 minutos a temperatura ambiente, lava los bazos con PBS y vuelve a suspender el pellet en 250 microlitros de PBS suplementado con albúmina sérica bovina y 2 milimolares de EDTA para el contar. A continuación, aísla las células B2 positivas para Ly6 con las perlas inmunomagnéticas adecuadas según el protocolo del fabricante y siembra las células positivas enriquecidas para Ly6 B2 a 1 por 10 a 5 por 100 microlitros de medio completo por densidad de pozo en una placa negra o blanca de 96 pozos. Preparar el inóculo bacteriano en la multiplicidad deseada de infección en un volumen final de 100 microlitros por pozo y añadir 100 microlitros de inóculo o medio bacteriano solo a cada pozo, para una incubación de 1 hora en la incubadora de cultivo celular.
Al final de la incubación, se sustituye el medio por 200 microlitros de medio completo fresco suplementados con 100 microgramos por mililitro de gentamicina para eliminar cualquier bacteria extracelular restante y devolver las células a la incubadora de cultivo celular durante 2 horas adicionales. Al final de la incubación y en cada momento experimental posterior, se utiliza un lector de placas para medir la luminiscencia en cada pozo de la placa de cultivo con tapa antes de devolver la placa a la incubadora de cultivos celulares hasta la siguiente lectura.