Detección in situ de bacterias en secciones de tejido gingival de ratón

Toma una sección gingival de ratón infectada con bacterias patógenas, pretratada para acceder al ADN bacteriano.

Aplica un tampón con una sonda de ADN marcada con digoxigenina dirigida al ADN bacteriano.

Coloca una funda y sella para evitar la deshidratación de la muestra.

Introduce calor para desnaturalizar el ADN y luego incuba bajo condiciones calurosas y húmedas para permitir la hibridación con sonda.

Enfría la corredera y quita la cubierta, y lava varias veces con buffer para eliminar las sondas sueltas.

Añade una solución bloqueante para evitar la unión inespecífica de anticuerpos.

Incubar con anticuerpos conjugados con enzimas que se unen a la digoxigenina.

Lava para eliminar los anticuerpos no unidos.

Añadir un inhibidor para inactivar selectivamente la enzima endógena.

Aplica un sustrato que reaccione con la enzima para dar un precipitado de color.

Enjuaga con agua para eliminar el exceso de sustrato.

Añade un tinte para teñir los núcleos.

Lava para eliminar el exceso de tinte.

Deshidrata en etanol y trata con xileno para aumentar la transparencia del tejido.

Monta la sección.

Bajo un microscopio, visualiza las bacterias dentro de la sección.

Empieza el trabajo in situ sumergiendo primero las láminas en 2x SSC durante 20 minutos. Mientras tanto, diluir la sonda marcada a 1 nanogramo por microlitro en un buffer de hibridación. Para un control negativo, utilice una concentración 10 veces mayor que la sonda no marcada. Luego, desnaturaliza las sondas calentándolas a 90 grados Celsius durante 10 minutos, y luego enfríalas rápidamente sobre hielo.

A continuación, aplica el mismo volumen de dilución de la sonda a cada lámina que la proteinasa K. Luego, cubre cuidadosamente las secciones con barbote y sella con esmalte de uñas. Ahora, calienta las láminas en un bloque de máquina PCR a 90 grados Celsius durante 10 minutos y transfierelas a una incubadora humidificada a 45 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, enfría los deslizamientos a 4 grados Celsius durante media hora y luego retira cuidadosamente los deslizamientos de la tapa. Los tejidos son frágiles. Por último, pasa las láminas por una serie de buffers SSC a temperatura ambiente.

Lava las láminas híbridas in situ durante 5 minutos en MABT. Luego, aplica entre 50 y 400 microlitros de solución bloqueante al 1% Tween 20 durante 20 minutos. Tras la incubación en bloque, aplicar entre 50 y 400 microlitros de 1 a 1000 anticuerpos fosfatasa alcalina anti-DIG en solución bloqueadora.

Déjalo unirse durante 90 minutos a 37 grados Celsius. Después de aplicar el primario, lava las láminas en MABT durante 10 minutos. Luego, durante 5 minutos, pon las diapositivas en un búfer de detección con un 1% de Tween 20.

Ahora aplica entre 50 y 400 microlitros de levamisol de 1 milimolar en solución tampón de detección en cada lámina, e incuba durante 5 minutos para inactivar la fosfatasa alcalina endógena. A continuación, añade entre 50 y 400 microlitros de NBT/BCIP diluido en un buffer de detección de 1 a 100 por portaobjetos, y deja que las láminas incuben durante 2 a 3 horas en una cámara humidificada, según la experiencia.

Enjuaga los tobogáns con agua de la DI. Luego, aplica verde de metilo al 0,05% del peso por volumen y deja que la contratinción actúe sobre el tejido durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lava las láminas con agua DI de nuevo y luego deshidrázalas con etanol al 100%, seguido de un baño en xileno. Finalmente, aplica 80 microlitros de medio de montaje y cubre las láminas.