Monitor de la motilidad gastrointestinal (GIMM)

El monitor de motilidad gastrointestinal proporciona un método sencillo y reproducible para monitorear la motilidad propulsiva en segmentos aislados del colon distal de cobayo. Este procedimiento comienza extrayendo el colon del animal y sumergiéndolo en una solución de Krebs oxigenada y calentada. Luego, se insertan bolos fecales en el extremo oral y se los impulsa a lo largo del segmento de colon, lo cual se registra en video.

Se capturan grabaciones del avance del pellet fecal a lo largo del segmento, y el software rastrea el progreso del pellet fecal. Además del análisis de las tasas de motilidad propulsiva, se pueden construir mapas espacio-temporales a partir de los segmentos de video capturados para evaluar los patrones de actividad motora espontánea. En última instancia, este sistema puede utilizarse para determinar los efectos de compuestos farmacológicos sobre los patrones de motilidad propulsiva, así como para evaluar los cambios resultantes de condiciones fisiopatológicas.

La principal ventaja del monitor de motilidad gastrointestinal frente a los métodos tradicionales de monitoreo de la motilidad colónica es que este sistema permite una evaluación cuantitativa continua de la propulsión de bolos. Además, los videos digitales de cada ensayo en un experimento determinado se guardan en el sistema y pueden volver a analizarse según sea necesario. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología gastrointestinal, como el papel de diversos sistemas de neurotransmisores en la motilidad colónica mediante la evaluación de los efectos de agonistas o antagonistas de receptores sobre la propulsión de bolos, así como estudiar los efectos de condiciones como el estrés o la inflamación en los patrones de motilidad propulsiva.

Para preparar un segmento del colon distal para el monitor de motilidad gastrointestinal, coloque el colon aislado de cobayo en hielo. En solución fría de Krebs, realice una pequeña incisión en el extremo oral para poder distinguirlo cuando posteriormente se coloque el colon en el baño de órganos. El tejido puede permanecer en solución de Krebs fría hasta dos horas antes del experimento.

Los intentos de utilizar este enfoque en intestinos de rata y ratón han tenido un éxito limitado, mientras que se pueden obtener resultados consistentes con el colon de la cobaya. Cuando esté listo para comenzar el experimento, transfiera el colon al baño de órganos. El siguiente paso generalmente representa el mayor desafío para las personas.

Nuevo en esta técnica, se debe aplicar la cantidad correcta de tensión al fijar el segmento de colon en el baño de órganos, ya que el grado de tensión sobre la preparación puede afectar la motilidad mediante la activación de reflejos de estiramiento. Por este motivo, el segmento colónico debe fijarse de la misma manera y por el mismo investigador en cada experimento dentro de un conjunto determinado de experimentos.

Mientras se identifican los extremos oral y anal, sujete con alfileres un segmento de al menos cinco centímetros de colon distal en cada extremo dentro del baño de órganos, dejando un pequeño grado de holgura para que el segmento pueda moverse libremente hasta un centímetro en el centro. Después de fijar el colon, retire cuidadosamente los restos de tejido conectivo de la pared externa para que no interfieran con el software de seguimiento automático. El sistema de monitoreo de la motilidad gastrointestinal consta de una cámara de perfusión que se ilumina desde abajo, una cámara de video digital colocada encima de la cámara, un ordenador y bombas peristálticas conectadas a un baño de agua caliente que unen los conductos de entrada y salida con el baño de órganos, perfundiendo continuamente el baño de órganos con solución de Krebs previamente oxigenada a 37 grados Celsius a un flujo de 10 mililitros por minuto.

El extremo oral del colon, marcado por la incisión realizada previamente, debe orientarse hacia el investigador. Para facilitar la colocación del pellet fecal. Permita que la preparación se equilibre durante al menos 30 minutos antes de la adquisición de datos.

Normalmente, los pellets nativos serán expulsados durante este tiempo. Para preparar el monitor de motilidad gastrointestinal para la adquisición de datos, primero encienda la fuente de iluminación luminosa, luego encienda el software personalizado y configure un nuevo experimento en la aplicación. Comience con un segmento colónico de un animal sano y sin aplicar ninguna droga, con el fin de obtener un valor control para la tasa de propulsión de los pellets fecales.

Dado que la tensión sobre el segmento de colon puede cambiar durante el calentamiento del tejido en el baño de órganos, enrolle el segmento de modo que se mantenga la cantidad deseada de holgura. El colon debe moverse libremente hasta un centímetro en el centro; recorte el tejido sobrante de la preparación según sea necesario. Haga doble clic en un ensayo dentro de un nuevo experimento y encienda la cámara haciendo clic en el interruptor de alternancia.

Comience insertando una bolita fecal recubierta con epoxi en el extremo oral del segmento colónico. Para iniciar la peristalsis, haga clic en el botón de grabación en la computadora para comenzar la grabación. El movimiento de la bolita en dirección anal es registrado por la cámara de video, y las grabaciones digitales se almacenan en la computadora para su análisis posterior.

Cuando el pellet haya alcanzado el extremo del segmento colónico, haga clic en el interruptor de grabación para detener el registro. Realice de tres a cinco ensayos en una sola preparación, con un período de recuperación de cinco minutos entre cada uno. Para determinar los efectos de ciertas condiciones o fármacos sobre la motilidad colónica, realice de tres a cinco ensayos en cada preparación para cada condición experimental.

Además, realice cada experimento en al menos cinco colon diferentes provenientes de al menos cinco animales distintos. La velocidad de propulsión del pellet fecal se calcula como el tiempo que tarda el pellet en recorrer X centímetros del segmento colónico. Los resultados se muestran en gráficos de distancia respecto al tiempo, en los cuales el eje Y representa la distancia recorrida por un pellet fecal en milímetros, y el eje X representa el tiempo en segundos, como se muestra en este ejemplo proveniente de un colon control, en el que el pellet avanzó linealmente a una velocidad de aproximadamente dos milímetros por segundo.

Los datos resultantes pueden exportarse como archivos de texto a Excel para su posterior análisis. En contraste con el control, la administración de ciertos fármacos o la inflamación en el colon puede provocar patrones de motilidad alterados, como motilidad detenida u obstruida. Los videos digitales obtenidos de cada corrida individual pueden convertirse en mapas espacio-temporales mediante software personalizado para evaluar los patrones de actividad motora espontánea o para evaluar visualmente el progreso de una bolilla fecal en el eje horizontal.

Los cambios en el diámetro del colon se representan gráficamente en función del tiempo convirtiendo la imagen del colon en cada cuadro de video en una silueta y calculando, luego convirtiendo, el diámetro a lo largo de toda su longitud en escala de grises. El resultado final es que el bolo en las áreas de relajación aparece negro, mientras que las áreas de contracción aparecen blancas, como lo ilustra el mapa espacio-temporal de un colon control. El eje Y representa la posición del bolo a lo largo del tiempo.

Si bien el eje x representa la distancia que el pellet recorrió a través del segmento del colon en comparación con el control, estos mapas espacio-temporales muestran una motilidad detenida y obstruida causada por la administración de ciertos fármacos o por inflamación en el colon. Con este avance, ahora podemos evaluar la motilidad a lo largo de un segmento del colon, en lugar de simplemente determinar la velocidad sobre todo el segmento, así como evaluar la actividad espontánea en el mismo preparado. Tras recibir capacitación en un protocolo sencillo, esta técnica puede realizarse en aproximadamente dos horas, y se pueden llevar a cabo estudios de más de un animal en un mismo día siguiendo este procedimiento.

Otros enfoques in vitro, como las grabaciones electrofisiológicas, pueden realizarse en el mismo tejido.