Investigación de la actividad microbiana intestinal humana en exopolisacáridos

Comienza con el sobrenadante producido por la microbiota intestinal humana durante la fermentación in vitro de exopolisacáridos. El sobrenadante contiene ácidos grasos de cadena corta desprotonados (SCFAs) y otros metabolitos.

Añade ácido metafosfórico para bajar el pH del sobrenadante y vórtice para mezclar bien. Esto convierte los SCFA en sus formas protonadas, adecuadas para el análisis de cromatografía de gases.

Centrifugar para separar los restos y recoger el sobrenadante que contiene SCFAs y otros metabolitos.

Filtra el sobrenadante para eliminar residuos residuales y evitar interferencias con la cromatografía.

En un sistema de cromatografía de gases de alto rendimiento, inyecta el sobrenadante en la entrada calentada para vaporizarlo. Luego, mezclar el vapor con un gas inerte y hacerlo pasar por una columna polar de fase estacionaria para separarlo.

Los SCFA interactúan con la fase estacionaria de la columna y se separan según su volatilidad, con ácidos de cadena corta eluyendo antes que los más largos.

Identificar las concentraciones de diferentes SCFA comparando los resultados con estándares internos. Esto refleja la degradación microbiana de exopolisacáridos en condiciones similares a las intestinales

Para estudiar los efectos del EPS en la producción de SCFA, añadir 1 mililitro de los sobrenadantes fermentados a tubos de centrífuga de 2 mililitros y añadir 0,2 mililitros de ácido metafosfórico al 25% peso/volumen a cada muestra. Vortex para mezclar bien las soluciones. Centrifuga las mezclas a 13.000 g durante 20 minutos.

Mientras tanto, preparar soluciones de 120 milimolares ácidos acético, propiónico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico en tubos. Luego añade 1 mililitro de cada ácido preparado a un tubo que contiene 1,2 mililitros de ácido metafosfórico al 25% peso/volumen y cárgalos en la botella de muestra del instrumento de cromatografía de gases como cócteles estándar.

Saca los tubos de la centrífuga y transfiere los sobrenadantes a tubos nuevos. Utiliza una jeringuilla equipada con filtro de 0,22 micras para filtrar los sobrenadantes en nuevos tubos para análisis de cromatografía de gases.