Imagen en lapso de tiempo de la segregación cromosómica en bacterias marcadas con fluorescencia

Comienza con una base de agarosa rica en nutrientes sobre un marco metálico que contiene bacterias que expresan orígenes cromosómicos marcados con fluorescencia y microsferas fluorescentes.

La almohadilla de agarosa apoya la inserción y movilidad bacteriana, y las microesferas fluorescentes sirven como referencia para seguir la segregación cromosómica.

Añadir aceite de inmersión a la lente objetivo en la cámara de incubación precalentada de un microscopio de campo amplio invertido.

Coloca la muestra sobre la lente y luego enfoca en una región que contenga varias bacterias y al menos una microesfera fluorescente.

Inicia imágenes en lapso de tiempo y captura tanto imágenes de contraste de fase como de fluorescencia.

El origen de replicación marcado con fluorescencia aparece como un cúmulo brillante cerca de un extremo de la célula.

Durante la división, el origen se duplica; un cúmulo permanece en el extremo original mientras el otro cúmulo migra al extremo de la celda recién formada.

Este sistema permite el seguimiento de la segregación cromosómica a lo largo de múltiples divisiones y puede adaptarse para visualizar procesos dinámicos similares en otras bacterias, incluidas especies patógenas durante las interacciones con el hospedador.

Para realizar la microscopía en time-lapse, enciende el microscopio y inicia el software de control del microscopio. Seleccione el objetivo correcto y los espejos y filtros adecuados para adquirir imágenes de contraste de fase, así como imágenes de proteínas fluorescentes verdes, fluorescentes rojas o fluorescentes amarillas. Añade una gota de aceite de inmersión de alta calidad sobre la lente del objetivo y en el fondo de la muestra preincubada a 32 grados Celsius.

Con el lado del agujero hacia el objetivo, coloca el marco metálico con la muestra sobre el escenario del microscopio y luego fija la muestra firmemente en el soporte del escenario. Concéntrate en las células moviendo la etapa en la dirección Z más cerca del objetivo. Cuando el aceite del objetivo y la muestra haga contacto, mueve la etapa en la dirección X/Y.

Cambia al software Metamorph y abre la herramienta Acquir. Selecciona Contraste de Fase en la lista desplegable de Configuración y establece el Tiempo de Exposición a 100 milisegundos. Haz clic en Mostrar en directo, Trae celda al plano focal y mueve el escenario en dirección X/Y hasta que varias celdas individuales sean visibles en el campo de visión.

Asegúrate de que al menos una microesfera fluorescente esté en la región de visión para alinear posteriormente las imágenes adquiridas. A continuación, abre el asistente de Adquisición Multidimensional del software de control del microscopio para configurar un experimento en lapso de tiempo que permita al microscopio adquirir imágenes en múltiples longitudes de onda y posiciones de escenario si es necesario.

En la pestaña principal, activa time-lapse y Múltiples Longitudes de Onda. Aparecerán pestañas adicionales en el lado izquierdo de la ventana. Haz clic en la pestaña Guardar y selecciona Directorio para seleccionar una carpeta vacía en el disco duro del ordenador y guardar las imágenes adquiridas, luego activa Incrementar Nombre Base Si Existe Archivo para asegurarte de que los conjuntos de datos consecutivos no sobrescriban los anteriores. Asigna al experimento un nombre con fecha y el nombre o título de la cepa.

Haz clic en la pestaña de time-lapse para ajustar los parámetros del time-lapse, luego establece el Intervalo de Tiempo en 20 minutos y la Duración en 24 horas. El número de puntos de tiempo cambiará automáticamente. Ahora, haz clic en la pestaña de Longitudes de Onda.

Selecciona el número de longitudes de onda que quieres adquirir para cada imagen en cada momento cambiando el número. Seleccione permitir la posición AF memorizada por hardware separada para cada longitud de onda. Haz clic en la pestaña de Primera Longitud de Onda desde arriba.

En la lista desplegable de Iluminación, selecciona Contraste de Fase. Selecciona 100 milisegundos para exposición y, en la lista desplegable Adquirir, selecciona Cada punto de tiempo. Desactiva Exposición Automática en la lista desplegable seleccionando Nunca y selecciona Cada adquisición en la lista desplegable para Enfoque automático.

Ajusta la exposición para cada longitud de onda, como acabo de demostrar usando los siguientes parámetros. Luego, para adquirir imágenes de varias posiciones del escenario, en la pestaña principal, active Múltiples Posiciones del Escenario. Haz clic en la pestaña Stage y haz clic en el botón Live para ver el campo de visión.

Mueve el escenario en la dirección X/Y hasta que haya un ROI en el campo de visión. Guarda las coordenadas X y Y en la pestaña de Etapa haciendo clic en el signo más. Mueve el escenario de nuevo en la dirección X/Y hasta que encuentres un nuevo retorno de inversión y guarda las coordenadas haciendo clic en el signo más.

Continúa hasta que se guarde el número deseado de regiones. Comprueba una vez más que las celdas estén enfocadas haciendo clic en las diferentes posiciones X e Y guardadas, y inicia el enfoque automático por hardware pulsando AFC para mantener la posición Z guardada constante durante el experimento. Inicia la grabación en time-lapse en el asistente de Adquisición Multidimensional del software de control del microscopio haciendo clic en Adquirir.

Comprueba que las celdas sigan enfocadas después de los primeros puntos de tiempo en las grabaciones en time-lapse para maximizar la calidad de las imágenes y reenfocar si es necesario.