Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:47 min. • February 26th, 2026
Comienza con dos microplatos con fondo de cristal que contienen suspensiones de una bacteria formadora de biofilm.
El plato de tratamiento contiene una enzima activa que altera la señalización, mientras que el control incluye la enzima inactivada.
Cubre los platos e incuba para permitir la adhesión bacteriana a la superficie del microplato.
Lava para eliminar las células no adherentes, luego introduce un medio fresco que contenga las enzimas e incuba.
En el plato de control, las bacterias se comunican mediante moléculas de señalización y producen sustancias poliméricas extracelulares (EPS), formando un biofilm.
La enzima activa degrada las moléculas señalizantes, interrumpiendo su función y reduciendo la formación de biofilmes.
Repone con medio fresco e incuba aún más para reforzar los efectos disruptores de biofilm de la enzima.
Retira el medio, añade lectinas marcadas con fluorescencia e incuba para permitir la unión de la lectina al EPS.
Lava para eliminar cualquier lectina suelta.
Incuba con un fijador para preservar la arquitectura del biofilm y luego enjuaga el plato.
Adquiere imágenes de microscopía confocal para evaluar la supresión mediada por enzimas de la formación de biofilm.
Para realizar microscopía láser confocal (CLSM) de biopelículas S1 de A. baumannii , cultivar un cultivo de 5 mililitros de A. baumannii S1 en LB a 30 grados Celsius en una incubadora agitada durante 16 horas. Ajusta el cultivo de A. baumannii S1 a un OD600 de 0,8.
Luego usa LB fresco que contenga 1,2 miligramos por mililitro de enzima GKL purificada para diluir el cultivo, de 1 a 100, y añade 1 mililitro a un microplato de 35 mililitros con fondo de vidrio. Cubre el microplato con una tapa y colócalo en un recipiente de plástico de 10 litros y sérralo antes de incubar el recipiente a 30 grados Celsius durante tres horas. Después de retirar suavemente el medio, añade 1 mililitro de medio fresco que contenga 30 microlitros de enzima GKL purificada, y luego incuba a 30 grados Celsius durante otras 21 horas.
Retira suavemente el medio una segunda vez y sustituye por otro mililitro de enzima GKL en medio fresco. Incuba a 30 grados Celsius durante 24 horas. Tras la incubación, retira suavemente el medio y añade 500 microlitros de 5 microgramos por mililitro de aglutinina conjugada de germen de trigo Alexa Fluor 488 disuelta en HBSS.
Incuba el microplato a 37 grados Celsius durante 30 minutos para teñir las biopelículas. Para fijar las biopelículas, añade 500 microlitros de formaldehído al 3,7% disuelto en HBSS e incuba a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Usa 2 mililitros de HBSS para lavar el microplato una vez y luego retira la solución por completo.
Guarda el plato a oscuras a 4 grados Celsius antes de la imagen de CLSM. Para la imagen y análisis CLSM, utiliza un objetivo de 63 X para generar 97 pilas por imagen con un intervalo de 0,21 micras por pila.