Protocolo para las vacunas recombinantes para RBD basada en el SRAS: Preparación de la proteína, la vacunación de animales y la detección de neutralización

En este procedimiento, se prepara una vacuna recombinante que expresa la proteína RBD del SARS-CoV y se evalúa su capacidad para inducir actividad neutralizante frente a un pseudovirus del SARS. Primero, la proteína RBD se expresa y se purifica a partir del sobrenadante de cultivo de células 293T transfectadas. La proteína purificada se utiliza luego para inmunizar.

Se recolectan ratones y sueros de los ratones vacunados en diferentes puntos temporales tras la inmunización para cuantificar el potencial de neutralización de los sueros inmunes. Se realiza un ensayo de neutralización con virus pseudotipados; se produce un virus pseudotipado recombinante de SARS que expresa luciferasa, el cual se incuba con una muestra de suero titulada. A continuación, se evalúa la capacidad de estos virus neutralizados para infectar células que expresan el coreceptor ACE del SARS mediante la medición de la actividad relativa de luciferasa en las células infectadas.

El título de anticuerpos neutralizantes del 50 % puede entonces calcularse. Mi nombre es tu. Actualmente soy becario postdoctoral en el laboratorio.

La principal ventaja del ensayo de neutralización con pseudovirus frente a técnicas existentes, como los ensayos de neutralización basados en virus vivos, es que esta técnica es relativamente segura. No requiere un virus SARS infeccioso y puede realizarse en un laboratorio que no sea de nivel de bioseguridad tres. Mi nombre es el que demostrará el procedimiento y DU es investigador postdoctoral en mi laboratorio, quien se ha centrado en el desarrollo de vacunas contra enfermedades infecciosas emergentes como el SARS y la gripe. Descongele alícuotas del tampón estéril HBS 2X pH 7, cloruro de calcio 2,5 M y el plásmido RBD a temperatura ambiente.

Una vez que las soluciones se hayan descongelado, transfiera dos mililitros de dos XHBS a un tubo cónico de 50 mililitros; en un tubo de 15 mililitros, mezcle 200 microlitros de cloruro de calcio con 40 microgramos de plásmido RBD. Ajuste el volumen a dos mililitros utilizando agua destilada estéril a temperatura ambiente con una pipeta estéril de cinco mililitros. Añada la solución de plásmido a los dos XHBS gota a gota, manteniendo la mezcla bajo un vórtex constante pero suave.

Mantener este vórtice lento y continuo es crucial para obtener un precipitado de consistencia adecuada que permita una alta eficiencia de transfección. Almacene durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras esta incubación, agregue la mezcla gota a gota a un matraz que contenga células 293T con una confluencia del 50 al 70 %.

En un volumen de 40 mililitros de medio de cultivo celular, es importante distribuir la solución de transfección de manera uniforme. Mezcle inmediatamente el medio después de agregar la mezcla de transfección. Incube las células a 37 grados Celsius en un incubador con 5% de dióxido de carbono.

Después de ocho a 10 horas de incubación, retire el medio completo de cultivo celular y sustitúyalo por 50 mililitros de medio óptimo libre de suero fresco, uno, para evitar cualquier interferencia del suero en la posterior purificación de proteínas, y luego devuelva las células al incubador a 37 grados Celsius. Dos días después, recoja el sobrenadante, que contendrá la proteína RBD expresada, y centrifugue durante 15 minutos a 6.000 RPM para eliminar los restos celulares. Una vez que las células hayan sido sedimentadas, transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue un cóctel de inhibidores de proteasas.

Para evitar la degradación de proteínas, utilice níquel NTA super flow siguiendo las instrucciones del fabricante para purificar la proteína recombinante RBD del sobrenadante recolectado. Eluir la proteína RBD con un tampón que contenga 250 milimolares de OLE. A continuación, utilizando tubos Amicon Ultra 15, concentre la proteína purificada que contiene OLE mediante centrifugación a 3000 RPM a cuatro grados Celsius durante aproximadamente 15 minutos. Deseche el flujo pasante.

AÑADA PBS a los tubos de concentración de RBD y centrifugue nuevamente a 3000 RPM a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Repita el lavado dos veces. Para asegurar la eliminación completa del ole, la proteína purificada se disolverá ahora en PBS; pipetee la proteína hacia un tubo EOR de 1,5 mililitros limpio.

Finalmente, calcule la concentración de la proteína purificada utilizando un NanoDrop con PBS como blanco y almacene la muestra a menos 80 grados Celsius. Primero, agregue un mililitro de PBS estéril a un vial del sistema adyuvante de Sigma. Precaliente en un baño de agua a 40-45 grados Celsius y mezcle completamente el vial mediante vortex durante dos a tres minutos.

A continuación, prepare la emulsión de adyuvante proteico en un tubo einor de 1,5 mililitros. Mezcle la cantidad deseada de proteína purificada descongelada diluida en PBS con un volumen igual de sistema adyuvante y agite vigorosamente en vórtex durante dos o tres minutos. Asimismo, prepare emulsiones control mezclando el adyuvante con PBS solo. Subcutáneamente.

Inyecte al menos cinco ratones BC de cuatro a seis semanas de edad con 200 microlitros de la mezcla de inmunización inicial que contiene 20 microgramos de proteína por dosis, o con la emulsión control, 21 días después de la inoculación inicial por vía subcutánea. Inyecte dosis de refuerzo que contengan 10 microgramos de proteína en un volumen final de 200 microlitros cada una. Recolecte muestras de sangre de cada ratón antes de la inmunización inicial y 10 días después de cada vacunación, y almacene el suero aislado a menos 20 grados Celsius tras el tratamiento térmico.

Inactivación del complemento a 56 grados Celsius durante 30 minutos, 16 horas antes de la transfección, siembre las células 293T en placas de cultivo de tejidos de 100 milímetros a una densidad de 2 millones de células por placa. Prepare el reactivo de transfección como se describió anteriormente y transfecte simultáneamente las células con un plásmido que codifica la proteína S del SARS-CoV-2 y otro que codifica el genoma defectivo para ENV del VIH-1 que expresa luciferasa. Ocho a 10 horas posteriores a la transfección.

Sustituya el medio por 10 mililitros de medio DMEM fresco que contenga 10% de suero y luego devuelva las células al incubador. Dos días después, recolecte el sobrenadante que contiene el pseudovirus de SARS. Pase el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrones para eliminar los restos celulares y alícuota el virus.

Usar inmediatamente o congelar a menos 80 grados Celsius para uso futuro utilizando una placa de pipeta multicanal. Células 293T que expresan el receptor ACE2 del SARS-CoV en la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una concentración de 10.000 células por cien microlitros por pocillo e incubar las células a 37 grados Celsius durante 16 horas. Utilizar una placa de 96 pocillos separada para titular el virus pseudotipificado recombinante que expresa luciferasa y determinar la concentración adecuada de virus para el ensayo de neutralización en las filas A y B de la primera placa.

150 microlitros por pocillo de DMEM con 10 % de suero bovino fetal. A continuación, agregue 150 microlitros de virus sin diluir a las filas A1 y B1 y realice una dilución seriada duplicada al doble, transfiriendo 150 microlitros de los pocillos de la fila 1 a los pocillos de la siguiente fila, y así sucesivamente hasta la fila 11. Deseche los últimos 150 microlitros y no agregue virus a la fila 12.

Una vez realizada la dilución seriada y tras la incubación de las células T ACE 2 93 durante 16 horas, infecte las células transfiriendo 100 microlitros de cada pocillo de la placa de virus al pocillo correspondiente de la placa que contiene las células. Incube las células durante dos días a 37 grados Celsius para permitir que los virus infecten las células. Determine el nivel de infección en cada pocillo leyendo la placa en un luminómetro ultra 3 84.

La cantidad de infección es proporcional a la intensidad de la actividad de luciferasa. La concentración de virus a la que la unidad relativa de luciferasa es aproximadamente mil veces mayor que la unidad relativa de luciferasa de fondo de las células solas en la columna 12 se utilizará en el ensayo de neutralización. Prepare primero la neutralización en una placa separada de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal, añadiendo 150 microlitros de D-M-E-M con 10% F-B-S a los pocillos de la columna uno y 120 microlitros a los pocillos de las demás columnas.

A continuación, agregue tres microlitros de cada suero de ratón que se va a probar en pozos duplicados de la columna uno. En este ejemplo, los primeros dos pozos contienen suero diluido 50 veces proveniente de un ratón inmunizado con RBD. Los dos siguientes contienen suero de un segundo ratón inmunizado con RBD y los últimos cuatro pozos contienen suero de dos animales de control inmunizados con PBS. Utilizando una pipeta multicanal, realice una dilución seriada cinco veces del suero transfiriendo 30 microlitros de todos los pozos de la primera columna a los pozos de la segunda columna, y repita este procedimiento hasta la columna 11.

Deseche los 30 microlitros restantes y deje los pocillos en la columna 12 sin suero. A continuación, agregue 120 microlitros por pocillo de un pseudovirus SAR diluido a cada uno. Incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora para permitir que cualquier anticuerpo anti-RBD presente en el suero de ratón se una y neutralice el pseudovirus SARS.

Después de esta incubación, transfiera 100 microlitros de virus neutralizado de cada pocillo a los pocillos correspondientes en la placa de 96 pocillos que contiene células 293T que expresan ACE2. Incube las células a 37 grados Celsius durante 24 horas para permitir la infección. Una vez que las células hayan sido infectadas, retire el medio utilizando una pipeta multicanal y sustitúyalo con 100 microlitros por pocillo de medio fresco.

Devuelva la placa al incubador después de 72 horas a 37 grados Celsius. Una vez más, retire el sobrenadante. En este punto, cualquier pseudovirus que no haya sido neutralizado por el suero de ratón debería haber podido infectar las células utilizando una pipeta multicanal. Añada 60 microlitros por pocillo de un reactivo de lisis de cultivo celular luciferasa.

Coloque la placa en un agitador a temperatura ambiente y deje que las células se lisen durante una a dos horas. Una vez que las células hayan sido lisadas, transfiera 50 microlitros de los lisados celulares a una placa de luminómetro de 96 pocillos y agregue 50 microlitros por pocillo de sustrato de luciferasa. Utilice un luminómetro Ultra 3 84 configurado en modo de luminiscencia para placas de 96 pocillos para leer la placa y evaluar relativamente la actividad de la luciferasa en los diferentes pocillos, a partir de la cual se puede derivar el porcentaje de virus neutralizado.

Estos datos muestran que el porcentaje de neutralización del virus alcanzado es proporcional a la concentración de suero de ratones inmunizados con RBD. En contraste, el suero de animales inyectados con PBS no logra neutralizar el virus a ninguna concentración según estos datos. El NT 50 o título de suero en el que se neutraliza el 50 % del virus puede obtenerse fácilmente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la confianza y la paciencia son esenciales para el éxito de los experimentos. Después de ver estos videos, debería tener una mejor comprensión de cómo expresar una vacuna recombinante contra el SARS en líneas celulares mamarias y de cómo determinar la capacidad de inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes en modelos murinos.