Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:02 min. • February 26th, 2026
Comienza con una lámina que contiene una sección de tejido cardíaco fijada químicamente de un ratón infectado con Streptococcus pneumoniae, una bacteria patógena.
Esta infección provoca la formación de microlesiones extracelulares llenas de bacterias dentro de los músculos cardíacos.
Lava la sección con un amortiguador para eliminar cualquier fijador residual.
Aplica un detergente no iónico para permeabilizar las membranas celulares del huésped.
Lava de nuevo para eliminar cualquier detergente que quede.
Incuba la sección con un agente bloqueante para bloquear los sitios de unión inespecíficos.
Enjuaga para eliminar el agente bloqueante que no se le liga.
Introduce un anticuerpo primario que se une al polisacárido capsular de la bacteria.
Lava para eliminar cualquier anticuerpo no unido, luego añade un anticuerpo secundario verde marcado con fluoróforo que se une al anticuerpo primario.
Contra-tinte con un colorante nuclear para marcar los núcleos de la célula huésped.
Lava la sección y móntala usando un medio de montaje.
Observa la sección con microscopía confocal para visualizar las bacterias marcadas dentro de las microlesiones.
Utilizando una sección cardíaca de 5 micras sobre portaobjetos de vidrio cargados positivamente, primero congela las secciones, luego descongénalas y déjalas secar al aire. Fija las láminas en formalina amortiguada al 10% de neutro durante 10 minutos a 25 grados Celsius. Luego, retira el fijador con tres lavados y PBS durante cinco minutos por lavado.
A continuación, se permeabiliza el tejido con Triton X-100 al 0,2% en PBS durante 15 minutos. Quita el detergente con tres lavados más en PBS directo. Luego, bloquea el tejido con suero de cabra al 10% en PBS durante una hora. Tras un enjuague en PBS, cubre la sección con antisuero durante dos horas a 37 grados Celsius. Trata los controles negativos con antisuero para conejos ingenuos.
Dado que el tejido cardíaco absorbe fácilmente la tinción inmunofluorescente XI, lo que conduce a altos niveles de fondo, probablemente será necesario optimizar la concentración en el tiempo de incubación de los diferentes tipos de anticuerpos.
Dos horas después, lava el suero con PBS. Luego reemplaza la solución por un anticuerpo secundario y deja que las láminas incuben a 37 grados Celsius durante otros 30 minutos. Ahora, aplica DAPI a 5 miligramos por mililitro y lava las láminas con PBS. Por último, monta las láminas en FluorSave e imájalas con microscopía confocal.