Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:23 min. • February 26th, 2026
Tomemos biofilms patógenos derivados de bacterias cultivadas en agar nutritivo.
La biopelícula sin tratar presenta bacterias densamente empaquetadas dentro de una matriz extracelular protectora.
La biopelícula tratada con inhibidor presenta células de forma laxa dentro de una matriz dispersa.
Divide cada biofilm en dos, luego expone una mitad al tampón como control y la otra al etanol para imponer estrés antimicrobiano.
En la biopelícula no tratada y expuesta al etanol, la matriz densa reduce la difusión del etanol y limita la penetración celular, resultando en menos eliminación bacteriana.
En el biofilm expuesto al etanol y tratado con inhibidor, la matriz dispersa permite que el etanol penetre con mayor facilidad, lo que conduce a una mayor destrucción bacteriana.
Centrifuga los tubos y quita el sobrenadante. Añade buffer y sonicate para dispersar las celdas.
Placar las suspensiones diluidas e incubar para permitir el crecimiento de bacterias viables.
Contar unidades formadoras de colonias (CFU); menos UFC procedentes de la biopelícula expuesta al etanol y tratada con inhibidores confirman que la integridad de la matriz es esencial para la resistencia al etanol.
Toma una cuchilla limpia y corta las colonias de biofilm en dos partes iguales con la ayuda de la plantilla. Levanta cuidadosamente la mitad de la colonia con una espátula limpia y transfierela a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros, que contiene 500 microlitros de PBS.
Toma la segunda mitad de la colonia y transfierela a un tubo microcentrífuga que contiene 500 microlitros de etanol al 50%. Estos se utilizarán para evaluar la resistencia a los agentes esterilizantes. Después, de forma similar, toma la primera mitad de la colonia tratada con D-leucina y colócala en PBS.
Luego, toma la segunda mitad de esta colonia y transfierela a etanol. Incuba todos los tubos que contienen las mitades de biofilm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y luego, centrifugarlos durante cinco minutos a 18.000 veces g.
Con una pipeta, retira cuidadosamente el sobrenadante. Añade 300 microlitros de PBS y luego sonica las células a baja temperatura, con un microtip sonicator. Añade 700 microlitros adicionales de PBS para un volumen final de un mililitro.
A continuación, realiza una dilución en serie de 10 elevado al menos siete en PBS. Toma 100 microlitros de una de las diluciones e inocula una placa de Agar LB al 1,5 %. Repite este paso para otras dos diluciones por muestra.
Extiende el inóculo usando perlas de vidrio y luego incuba las placas durante la noche a 30 grados Celsius. Examina las placas y cuenta las unidades formadoras de colonias, o UFC. Tras calcular el valor de la UFC por mililitro, calcular el porcentaje de supervivientes en los tratamientos PBS frente a los tratamientos con etanol.