Preparación de muestras e imagen de bacterias marcadas con fluorescencia

Comienza con una corredera de vidrio grande con diapositivas de vidrio más pequeñas colocadas en cada borde en una doble capa.

Vierte agarosa fundida en el espacio y cúbrela con otro portaobjetos grande de cristal.

Enfría la instalación para solidificar la agarosa.

Quita las láminas de cristal y corta la agarosa en pequeñas almohadillas.

Coloca las almohadillas de agarosa dentro de un marco adhesivo unido a una corredera.

Tomemos un cultivo de bacterias patógenas, genéticamente modificadas para expresar un sistema de secreción marcado con fluorescencia esencial para la infección del huésped.

Utiliza una zona bacteriana densa y suélvala en agua.

Vórtice para dispersar las bacterias de forma uniforme.

Aplica la suspensión en la almohadilla de agarosa para inmovilizar las bacterias.

Sella con una funda para mantener la hidratación.

Bajo iluminación de campo claro, selecciona un campo de células para la imagen.

Optimiza los ajustes del microscopio para reducir el fotoblanqueo y aumentar la sensibilidad de la señal.

Cambia al canal de fluorescencia para detectar las bacterias marcadas con fluorescencia.

Empieza haciendo almohadillas de agarosa para imágenes de células vivas. Prepara unos 30 mililitros de una solución de agarosa al 1% de baja fusión en agua y cálbala en un matraz de cristal durante unos 90 segundos, retorciendo ocasionalmente hasta que la agarosa se disuelva por completo.

Coloca dos diapositivas de vidrio de 22 por 22 por 0,15 milímetros en el borde de una diapositiva de 25 por 75 por 1,1 milímetros, una encima de la otra. Luego, apila dos correderas más pequeñas en el otro borde. Pipetea aproximadamente 1 mililitro de la agarosa fundida en la lámina central entre las dos láminas superiores de vidrio y coloca otra lámina grande encima de la agarosa fundida, asegurándote de evitar la formación de burbujas de aire.

Enfría las láminas a cuatro grados Celsius durante 15 minutos y luego usa un bisturí o cuchilla para cortar suavemente la almohadilla en pequeños cuadrados. Fija un marco adhesivo de doble cara en una corredera de cristal de 25 por 75 por 1,1 milímetros y coloca varias almohadillas en la corredera. Disolver una gruesa zona de Legionella pneumophila en 1 mililitro de agua destilada doblemente.

Luego vórtice y pipete de 2 a 3 microlitros de la dilución sobre las almohadillas. Coloca suavemente una tapa de 58 por 24 por 0,15 milímetros sobre el armazón adhesivo. Selecciona las células para obtener imágenes usando iluminación de campo brillante.

Luego, en la ventana de captura del software del microscopio, ajusta el ND a 180 y el bin a 2 por 2. Utilizar el canal de 488 nanómetros para exponer la muestra durante 500 a 1000 milisegundos y validar la especificidad de la fluorescencia mediante imágenes de Legionella pneumophila no marcada con los mismos parámetros.