Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Microbiología
0 visualizaciones • 3:08 min. • March 31st, 2026
Empieza con un ratón cuyo tracto gastrointestinal está colonizado por Clostridium difficile, un patógeno bacteriano anaeróbio que forma esporas.
Sujeta al ratón y deja que defeque de forma natural en un tubo estéril prepesado.
Determina el peso neto de la muestra fecal restando el peso del tubo vacío del peso total para preparar las diluciones adecuadas.
Transfiere la muestra a un ambiente anaeróbico para preservar la viabilidad de la bacteria sensible al oxígeno.
Añade un buffer a la muestra y interrumpe mecánicamente su contenido para liberar su contenido en suspensión.
Incubar para permitir que los restos más grandes se asiente, reteniendo células bacterianas y esporas en el sobrenadante.
Realizar diluciones en serie del sobrenadante en el buffer.
Emplata las diluciones sobre un medio selectivo e incuba bajo condiciones anaeróbicas.
El medio promueve la germinación de esporas y el crecimiento selectivo de Clostridium difficile mientras inhibe bacterias competidoras, dando lugar a colonias distintas.
Cuenta las colonias para cuantificar la carga de Clostridium difficile en las heces y evalúa la colonización gastrointestinal.
Para recoger muestras de heces de ratones para su evaluación, primero sujeta ligeramente pero con firmeza al ratón por la piel flácida del cuello y la espalda, asegurándose de que el animal no esté en angustia.
Con el dedo meñique, levanta suavemente la cola del animal, dejando al descubierto el ano. Sujeta un tubo estéril de microcentrífuga de peso conocido justo debajo del ano del animal, asegurándote de que el tubo no toque directamente al ratón. Cuando el animal defece, recoge el pellet fecal en el tubo.
Guarda el tubo a temperatura ambiente hasta que se recojan todas las muestras necesarias. Pesa los tubos que contienen heces en una báscula analítica y registra la masa hasta cuatro decimales. Calcula el peso del pellet fecal restando el peso del tubo.
A continuación, calcula una dilución de uno a diez del contenido y vuelve a suspender en 1x PBS. Utiliza la punta de la pipeta para desintegrar suavemente la materia fecal y convertirla en solución. Incuba las muestras a temperatura ambiente durante 30 minutos, permitiendo que el contenido se asiente.
Manteniendo las soluciones anaeróbicas, haz diluciones en serie para cada muestra en 1x PBS. Transfiere 100 microlitros de cada dilución en serie a placas TCCFA. Utiliza un espallador estéril en forma de L y aplica el medio de forma uniforme a las placas.
Incuba las placas en condiciones anaeróbicas a 37 grados Celsius durante 24 horas. Finalmente, enumerar las colonias de C. difficile y calcular la unidad formadora de colonias por gramo de contenido fecal.