Name: La combinación de colorantes lipofílicos, In situ, inmunohistoquímica y la histología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprende a combinar colorantes lipofílicos, hibridación in situ, inmunohistoquímica e histología en tejido de ratón. Este método maximiza la información obtenida de un solo espécimen para correlacionar mutaciones genéticas con perfiles morfológicos y de expresión.

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Confocal imágenes se obtuvieron en la Universidad de Iowa Carver Centro de Imagen. El financiamiento fue proporcionado por una beca SBIR (MH079805) para apoyar BF adicionales para la cría de los ratones de este proyecto fue proporcionado por NIDCD (5R01DC00559007) para BF

<ol><li>Jensen-Smith, H., Gray, B., Muirhead, K., Ohlsson-Wilhelm, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+three-color+neuronal+tracing+in+fixed+tissue+using+NeuroVue+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-distance three-color neuronal tracing in fixed tissue using NeuroVue dyes.</a> Immunol Invest. 36, 763-789 (2007).</li>
<li>Tonniges, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-+and+bio-physical+characterization+of+novel+violet+and+near-infrared+lipophilic+fluorophores+for+neuronal+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Photo- and bio-physical characterization of novel violet and near-infrared lipophilic fluorophores for neuronal tracing.</a> Journal of Microscopy. , (2010).</li>
<li>Bartheld, C. S. von, Cunningham, D. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+tracing+with+DiI%3A+decalcification%2C+cryosectioning%2C+and+photoconversion+for+light+and+electron+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Neuronal tracing with DiI: decalcification, cryosectioning, and photoconversion for light and electron microscopic analysis.</a> J Histochem Cytochem. 38, 725-733 (1990).</li>
<li>Gurung, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+embryonic+midbrain+thalamic+and+thalamic+auditory+connection+development+in+mice+as+revealed+by+carbocyannine+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time course of embryonic midbrain thalamic and thalamic auditory connection development in mice as revealed by carbocyannine dye injection.</a> J Comp Neurol. 479, 309-327 (2004).</li>
<li>Fritzsch, B., Nichols, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiI+reveals+a+prenatal+arrival+of+efferents+at+the+differentiating+otocyst+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">DiI reveals a prenatal arrival of efferents at the differentiating otocyst of mice.</a> Hear Res. 65, 51-60 (1993).</li>
<li>Jahan, I., Kersigo, J., Pan, N., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurod1+suppresses+hair+cell+differentiation+in+ear+ganglia+and+regulates+hair+cell+subtype+development+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Neurod1 suppresses hair cell differentiation in ear ganglia and regulates hair cell subtype development in the cochlea.</a> PloS ONE. 5, e11661-e11661 (2010).</li>
</ol>

Tejido de ratón fue recopilada de conformidad con las directrices y normas establecidas por la Universidad de Iowa Cuidado de Animales institucional y el empleo (ACURF 0.804.066).

En este vídeo, se demuestra un método para combinar cuatro técnicas para maximizar la recogida de datos y la cohesión mediante la correlación de los datos dentro de un determinado animal (figura 3). Este enfoque reducirá la cantidad de cría y por lo tanto el tiempo necesario para obtener los datos publicables y mejorar la información sobre la co-localización y los efectos correlativos de los mutantes. A pesar de embriones de ratones se utilizaron en este vídeo, ratón adulto, así como otros animales como el pollo, Xenopus y pez cebra puede ser analizada utilizando estas técnicas también. Cuando se utilizan otras especies digestión de proteinasa k puede ser necesario modificar. Aquí usamos diferentes tintes fluorescentes NeuroVue para etiquetar específicamente hasta tres poblaciones neuronales de interés. La ventaja de estos tintes es que pueden ser utilizados en los ratones mutantes, que puede ser problemático cuando se basa únicamente en técnicas de inmunohistoquímica que pueden o no pueden ser afectados por las mutaciones a analizar, y que ellos llaman neuronas retrógradamente y anterogradely 5. Un estudio reciente también ha aumentado el número de poblaciones de neuronas que pueden ser etiquetados de forma simultánea a seis 2. Después, el colorante lipofílico seguimiento del mismo tejido de interés se pueden analizar utilizando hibridación in situ, para el análisis de la transcripción de genes y pueden ser posteriormente analizados mediante técnicas de inmunohistoquímica para la distribución de las proteínas. Este último análisis se puede complementar con la histología detallada que se puede añadir a la caracterización fenotípica 6. Este análisis multifactorial tiene el potencial para obtener nuevos conocimientos a través del análisis correlativo en el mismo animal que de lo contrario puede ser improbable, o al menos en la necesidad de protocolos más extensa y la cría de ratón.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; Hibridación:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Juego de tampón de lavado y bloqueo PC DIG</td><td>Grupo Roche</td><td>1585762</td><td></td></tr><tr><td>Tampón SSC 20x premezclado</td><td>Grupo Roche</td><td>1666681</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC) </td><td>Research Products International Corp.</td><td>D43060</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td><td>Research Products International Corp.</td><td>D20020</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple </td><td>Grupo Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Fragmentos Fab anti-Dig-AP</td><td>Grupo Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>enzima RNasa A 10 mg/ml</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Research Products International Corp.</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro Stericup 0.22&amp;mu;m; 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Discos de filtro 0.2&amp;mu;m; 25 mm</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Paquetes de solución salina tamponada con fosfato pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Inmunohistoquímica:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst Colorante</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>9460</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Histología:&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Medio de Inclusión Poly/Bed 812/DMP-30 </td><td>Polysciences, Inc.</td><td>08792-1</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de propileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>110205</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído al 50%</td><td>Fisher Scientific</td><td>G151</td><td></td></tr><tr><td>Montante DPX</td><td>Fluka</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>MidSci</td><td>55D1114</td><td></td></tr><tr><td>Bloque térmico</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-715-125D</td><td></td></tr><tr><td>Rotador</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 60&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trazado con colorante&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtijeras</td><td>Geuder</td><td>G-19775</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas finas</td><td>E.M.S</td><td>72680-F</td><td></td></tr><tr><td>Colorante NeuroVue: Marrón, Rojo, Jade</td><td>MTTI</td><td>FS-100(1,2,6)</td><td></td></tr><tr><td>1X tampón fosfato salino (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5368</td><td></td></tr><tr><td>Descomposición del alcance</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora ajustada a 36&amp;#x00B0;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-506DQ</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Leica Microsystems</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>Láminas</td><td>Surgipath</td><td>00240</td><td></td></tr><tr><td>Cubrebjetes</td><td>Surgipath</td><td>00106</td><td></td></tr><tr><td>RPI</td><td>Glicerol</td><td>G22025-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (4% y 0,4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr></tbody></table>

la combinación de colorantes lipofílicos, in situ</emhibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Combining Lipophilic dye, in situ Hybridization, Immunohistochemistry, and Histology

Yendo más allá de la función de genes individuales para profundizarse en las redes reguladoras de genes requiere múltiples mutaciones combinadas en un solo animal. Este tipo de análisis de dos o más genes debe ser complementado con la hibridación in situ de otros genes, o inmunohistoquímica de las proteínas, tanto en el desarrollo de todo ello montado órganos o secciones de imagen de alta resolución de las alteraciones de la expresión celular y tisular. La combinación de múltiples alteraciones de genes requiere el uso de la creación o flipase eliminar condicionalmente genes y evitar la letalidad embrionaria. Sistemas de cría requiere mejorar dramáticamente el esfuerzo y el costo proporcional al número de genes mutados, con un resultado de muy pocos animales con el repertorio completo de las modificaciones genéticas deseadas. Amortización de la gran cantidad de esfuerzo y tiempo para obtener estos pocos ejemplares preciosos que son portadores de mutaciones múltiples requiere la optimización de los tejidos. Por otra parte, la investigación de un solo animal, con múltiples técnicas hace que sea más fácil de relacionar con los defectos genéticos borrado los perfiles de expresión. Hemos desarrollado una técnica para obtener un análisis más exhaustivo de un determinado animal, con la capacidad de analizar varias estructuras diferentes histológicamente reconocibles, así como la expresión de genes y proteínas todos los de la misma muestra en ambos órganos, y todo ello montado secciones. Aunque los ratones se han utilizado para demostrar la eficacia de esta técnica se puede aplicar a una amplia gama de animales. Para ello combinamos lipofílicas seguimiento medio de contraste, montar toda la hibridación in situ, inmunohistoquímica y la histología para extraer la máxima cantidad posible de datos.

Una combinación de diferentes técnicas para maximizar la recogida de datos a partir de tejido de ratón se presenta.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Ir más allá de la función de un solo gen para profundizar en las redes de regulación génica requiere la combinación de múltiples mutaciones en un solo animal. Tal análisis de...

Ir más allá de la función de un solo gen y analizar redes reguladoras génicas requiere múltiples mutaciones en un solo animal. En este sistema, optimizamos la cantidad de datos generados a partir de un único tejido para correlacionar mutaciones genéticas con perfiles morfológicos y de expresión. Esto se logra primero inyectando un colorante lipofílico para visualizar varias poblaciones neuronales discretas.La hibridación in situ se realiza para visualizar el patrón espaciotemporal de los transcritos génicos. Mientras que la inmunohistoquímica refleja patrones específicos de expresión proteica, la dimensión adicional del corte histológico contribuye a la caracterización del fenotipo. Este sistema experimental permite analizar varias estructuras reconocibles histológicamente, así como la expresión génica y proteica, todo a partir de la misma muestra, tanto en preparaciones montadas enteras como seccionadas. Se describe un sistema que combina el rastreo con colorantes lipofílicos y la hibridación in situ, la inmunohistoquímica y la histología.Esta técnica maximiza la información obtenida de un único espécimen al correlacionar la morfología con la expresión génica y proteica para todas las disecciones y manipulaciones de tejidos. Fije los animales en paraformaldehído al 4 % en tampón fosfato 0,1 molar mediante perfusión transcardial utilizando bombas peristálticas con agujas de tamaño adecuado. Dado que los DY son fotosensibles, guárdelos en un compartimento cerrado y oscuro, y para evitar la contaminación cruzada, designe un juego separado de instrumentos para manipular cada colorante bajo un microscopio estereoscópico.Determine un sitio de aplicación del colorante para marcar selectivamente la población neuronal en estudio y no otras estructuras ajenas. Extraiga el tejido ajeno con el fin de confirmar visualmente el sitio elegido y el acceso para la colocación del colorante. Ahora corte las tiras de filtro de colorante neuro view precargadas en trozos triangularmente proporcionados con tijeras microquirúrgicas.Asegúrese de cortar un trozo lo más pequeño posible para evitar la etiquetación de otras estructuras durante la inserción en tejidos blandos, como el cerebro directamente. Inserte el filtro utilizando un vértice del triángulo del filtro para perforar el tejido. Para tejidos más rígidos, realice una incisión para facilitar la inserción del D. No utilice una aguja de disección para empujar el filtro dentro del tejido.Coloque los especímenes en un vial cerrado herméticamente con paraformaldehído al 4 % e incube a 36 grados Celsius en la oscuridad durante dos a 14 días, según la edad y la distancia de difusión que deba recorrerse. Mediante un microscopio estereoscópico con fluorescencia epiluminiscente, verifique que el colorante haya difundido hasta la ubicación deseada y seccione el tejido de interés. Monte el espécimen sobre un portaobjetos con glicerol para su observación mediante un microscopio confocal.Después de obtener imágenes de los ojos lipofílicos en el microscopio confocal, transfiera las muestras a un tubo eppendorf de dos mililitros libre de RNAsas y enjuague con PBS libre de RNAsas para eliminar sistemáticamente el glicerol. Procese las muestras mediante deshidratación e hidratación con una serie graduada de metanol a cuatro grados Celsius. Comience con una incubación en metanol al 100% durante al menos una hora y luego reduzca hasta metanol al 25% durante 15 minutos.Lave tres veces con PBS al 1x durante cinco minutos cada vez. Diga el tejido con dos microlitros de proteinasa K al stock de 20 miligramos por mililitro en dos mililitros de PBS fresco. Supervise la reacción de digestión mediante el cambio en la opacidad del tejido, de opaco a casi transparente.Para detener la digestión enzimática, incube las muestras en paraformaldehído al 4% durante cinco minutos. Luego, lave con PBS una vez durante un minuto, seguido de tres lavados de cinco minutos cada uno. Descarte el lavado final con PBS prestando especial atención a eliminar la mayor cantidad posible como un paso previo a la hibridación.Incube las muestras en 1,8 mililitros de hibridación. Mezcle durante una hora a 60 grados Celsius en un inversor, desnature el ADN de esperma de salmón mediante incubación a 85 grados Celsius durante 10 minutos y coloque en hielo; agregue 200 microlitros de ADN desnaturalizado de cadena sencilla y aproximadamente 100 nanogramos de riba marcada con DIG. Incube cada muestra con la sonda durante la noche a 60 grados Celsius en un horno de hibridación.Procese las muestras con tres lavados de 10 minutos con SSC al doble durante 60 grados Celsius en el horno de hibridación. Es importante eliminar cualquier actividad de fosfatasa alcalina endógena con un lavado con SSC al doble durante 60 minutos a 70 grados Celsius en un bloque térmico ISO. Lave las muestras con PBS durante cinco minutos.Ahora sustituya el PBS y agregue un microlitro de 10 miligramos por mililitro de RNasas A e incube durante 60 minutos a 37 grados Celsius en un bloque térmico ISO temp. Deseche el PBS con RNasas A y lave tres veces con solución de lavado durante 10 minutos cada vez.Finalmente, caliente y active cualquier ARN restante mediante una incubación de 60 minutos a 70 grados Celsius en un bloque térmico ISO. El paso final consiste en visualizar la sonda de ARN. Incube las muestras en tampón de bloqueo al uno por ciento durante una hora.Deseche el tampón de bloqueo y agregue dos mililitros de tampón de bloqueo que contenga un microlitro de anticuerpo anti-ditch a cada muestra. Incube durante la noche y lave varias veces con tampón de lavado al uno por ciento, según se indica. A continuación, incube las muestras en tampón de lavado al uno por ciento durante la noche.Lave las muestras con tampón de detección 1X durante 10 minutos y transfiera las muestras a una placa de pocillos. Deseche el tampón y desarrolle el color con BM purple, ya que BM.Purple es sensible a la luz. Cúbralo con papel de aluminio o una caja cuando se alcance la intensidad de señal deseada.Lave las muestras con un volumen de tampón de detección en los pocillos durante cinco minutos. Observe las muestras mediante microscopía de transmisión o almacénelas en paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius. Elimine los colorantes lipofílicos del tejido con una serie graduada de etanol si es necesario.Luego, rehidrate el tejido agregando PBS progresivamente durante cinco a 10 minutos. A continuación, bloquee el tejido durante una hora en suero de cabra normal al 2,5 % y Triton X-100 al 0,5 % a temperatura ambiente en agitación, incube con el anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo durante 48 horas a cuatro grados Celsius en agitación, lave tres veces con PBS durante una hora cada vez, bloquee nuevamente las muestras y luego incube con el anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo diluido en la solución de bloqueo durante 12 a 24 horas a cuatro grados Celsius en agitación. A partir de este momento, se debe tener cuidado de proteger la muestra de la luz, ya que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.Nuevamente, lave las muestras tres veces con PBS durante una hora cada vez. Finalmente, analice los especímenes mediante imágenes con microscopía epi-fluorescente y confocal. La inclusión en resina epoxi y el corte requieren la fijación del tejido en 2,5 % de GLUTARALDEHÍDO y 1 % de PFA en tampón fosfato 0,1 molar, generalmente durante la noche en un vial de muestra de vidrio; deshidrate el tejido mediante incubaciones con etanol en concentraciones crecientes; ahora pase a los disolventes incubando de uno a uno etanol absoluto con óxido de propileno durante cinco minutos, seguido de cinco lavados de 10 minutos cada uno solo con óxido de propileno; infiltre la muestra con resina mediante una incubación sencilla en una mezcla uno a uno de óxido de propileno y resina durante la noche en agitador.Vierta la solución con la muestra en un molde de inclusión plano y déjela sobre la encimera durante cuatro a seis horas para que se evapore el óxido de propileno. Transfiera las muestras a resina al 100 % durante cuatro horas en el molde final. Incluya las muestras en resina y coloque una etiqueta.Deje que la resina se polimerice incubando a 60 grados Celsius durante 24 a 48 horas. Para minimizar la resina extraña, corte el bloque de resina con una cuchilla de afeitar según sea necesario. En un ultramicrotomo.Corte secciones seriadas de uno a dos micrones, monte e imagine las muestras utilizando microscopía de transmisión y microscopía fluorescente epiluminiscente. Diferentes longitudes de onda de colorantes lipofílicos pueden facilitar la visualización de las proyecciones centrales de tres nervios craneales diferentes. Aquí, el colorante lipofílico se coloca en las porciones periféricas de los nervios trigémino, glosofaríngeo y vago.Tras la incubación para la difusión del colorante, los procesos centrales del nervio hacia el bulbo raquídeo se visualizan mediante microscopía de campo claro. Cuando se disecciona y monta en plano el encéfalo posterior, se observa claramente alguna marcación en los procesos centrales de los tres nervios marcados. Mediante microscopía de campo claro, el microscopio confocal permite la tridimensionalidad, en la que se iluminan áreas específicas, y el uso de tres colorantes diferentes permite evaluar la distribución de cada población.En relación con los demás, aquí, los aferentes del oído interno se trazan en un ratón recién nacido mediante neurovisión. En rojo en C, hibridación in situ para prox1, y una combinación de inmunorreactividad frente a anti-tubulina y anti-prox1 para visualizar los aferentes.Además, una sección de resina epoxi de dos micrómetros de grosor muestra el oído interno como una sección transversal. Al realizar este procedimiento, es importante elegir cuidadosamente la ubicación del trazador lipofílico. Un buen conocimiento de la neuroanatomía será útil en este proceso; asimismo, téngase precaución en todos los pasos sensibles a la luz.Este procedimiento reducirá la cantidad de reproducción y el tiempo necesario para obtener datos publicables, al mismo tiempo que mejora la información sobre la colocalización y los efectos secundarios en mutantes.

combining-lipophilic-dye-situ-hybridization-immunohistochemistry

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Una técnica que combina en la tinción de tetrámero situ e hibridación in situ (ISTH) permite la visualización, la cartografía y el análisis de la proximidad espacial de virus específicos de células T CD8 + a sus infectados por el virus objetivos y la determinación de las relaciones cuantitativas entre estos efectores inmunes y los objetivos a los resultados de la infección.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

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Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Aquí se describe un protocolo de immunohistochemical fluorescente multiplex la coloración y la proyección de imagen para la localización simultánea de múltiples antígenos asociados a cáncer de linfoma. Este protocolo puede ampliarse para el análisis de colocalización de marcadores biológicos en todas las secciones de tejido.

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Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.

Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión

Aprende a combinar colorantes lipofílicos, hibridación in situ, inmunohistoquímica e histología en tejido de ratón. Este método maximiza la información obtenida de un solo espécimen para correlacionar mutaciones genéticas con perfiles morfológicos y de expresión.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ, inmunohistoquímica y la histología

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