JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiología
0 vistas • 3:03 min • March 31st, 2026
Toma un cultivo bacteriano capaz de infectar tejido foliar.
Raspa las colonias y suspende en una solución salina.
Mide la densidad óptica para evaluar la concentración bacteriana y luego diluye hasta la OD deseada.
Realizar diluciones seriadas para alcanzar la concentración final del inoculo.
Añade un tensioactivo para reducir la tensión superficial y asegurar una propagación uniforme de bacterias en la hoja.
Transfiere la suspensión a una placa de Petri.
A continuación, coloca dos palos de madera sobre la parte superior de una olla de Arabidopsis .
Invierte la planta sobre el plato, sumergiendo las hojas en la suspensión.
Coloca el montaje en una cámara de vacío y aplica un pulso de vacío
El vacío aplicado elimina el aire del tejido foliar a través de aberturas naturales.
Liberar el vacío restaura la presión atmosférica, forzando bacterias a entrar en las hojas.
Repite los pulsos para lograr la máxima infiltración.
Quita la olla. Luego seca el inóculo sobrante.
Las hojas infectadas por bacterias de Arabidopsis están listas para su análisis aguas abajo.
Extrae el stock de glicerol de la cepa de interés de Pseudomonas syringae desde menos 80 grados Celsius en una placa LB suplementada con los antibióticos adecuados. Incuba la placa a 28 grados Celsius durante 40 a 48 horas. Raspa la biomasa bacteriana y resuélvela en cinco mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares.
Mide la densidad óptica a 600 nanómetros y ajustala a 0,1 añadiendo 10 milimolares de cloruro de magnesio. Realizar diluciones en serie de cloruro de magnesio de 10 milimolares para obtener una concentración final de inoculo de 5 por 10 a la quinta UFC por mililitro. Luego, prepara 200 mililitros de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mililitros para las plantas de judía.
Antes de la inoculación, añadir el tensioactivo Silwet L-77 a una concentración final del 0,02% para la inoculación con judías y 0,01% para Arabidopsis. Para la infiltración de Arabidopsis , coloca dos palos de madera formando una X sobre la olla y coloca la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 centímetros de diámetro que contiene 200 mililitros de inoculum. Para la inoculación con hojas de judía, se insertan las plantas y la solución del inóculo en una cámara de vacío y se introduce la hoja en un tubo centrífuga cónico de 50 mililitros que contiene el inoculo.
Da un pulso de 500 milibares durante 30 segundos para infiltrarse en las hojas. Drena el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devuelve las plantas a su cámara de crecimiento correspondiente.